【摘要】 目的测定四物汤及其单味药中fe，cu，mg，ca，mn，zn 6种金属元素的含量，建立中药复方中微量金属元素检测的方法。方法用蒸馏水微波提取样品，运用火焰原子吸收光谱法测定，采用标准曲线法拟合计算含量。结果所测定的四物汤及其单味药中含有丰富的人体必需微量元素。结论该方法操作简单、结果准确，为中药复方中微量金属元素检测的理想方法。
【关键词】 火焰原子吸收光谱法； 四物汤； 金属元素
出自《和剂局方》的四物汤，是中医理血药之首。该方组成为：熟地15 g，当归、白芍各10 g，川芎6 g。功效与主治：补血养血，活血调经。该药用于血虚血滞所致的月经不调、痛经，是一切血虚常见的头晕眼花、面色无华、心悸、唇白、舌淡、脉细等症候的基本治疗方剂。一般来说，中药中的有效成分主要是由于其有机成分决定的，但无机离子的存在对其药效的发挥也有很重要的作用，人体如果缺乏铁、锌等元素都会造成一定程度的贫血。因此，中草药中无机元素的测定对于其药效的佐证有很重要的意义［1］。
1 仪器与试剂
1.1仪器
tas-990型原子吸收分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；fe，cu，ca，mn，zn，mg空心阴极灯〔威格拉斯（北京）有限公司〕；new human up 900超纯水器(韩国new human公司)；wx-4000微波快速反应系统（上海屹尧分析仪器有限公司）。
1.2 试剂
18.3 mω·cm超纯水（用单蒸水经上述超纯水器制得）；浓硝酸(优级纯，前进化学试剂厂）；fe，cu，ca，mn，zn，mg标准溶液，含量均为1 000 μg·ml-1（国家标准物质研究中心）。
2 方法与结果
2.1 稀释剂及标准溶液的制备
2.1.1 稀释剂用优级纯的硝酸和超纯水配制成质量分数为1%的稀硝酸，作为fe，cu，zn，mn标准溶液的稀释剂。称取1 g氯化锶，1 g氯化钾和1%硝酸配成混合溶液，作为钙和镁标准溶液的稀释剂。
2.1.2 标准溶液取上述6种元素标准溶液用稀释剂配制成相应浓度的溶液，其中fe，cu，zn，mn配制成混合标准溶液，ca，mg配制成混合标准溶液。配制的标准溶液的浓度见表1。表1 6种元素配制的系列标准溶液（略）
2.2 样品的处理熟地、当归、白芍和川芎均购自赣州市青年路华尔康大药房，切成碎片，放入烘箱内于85℃时烘2～3 h。按以下顺序配好药物，样品1：四物汤（熟地15 g，当归、白芍各10 g，川芎6g）；样品2：单味熟地40 g；样品3：单味当归40 g；样品4：单味白芍40 g；样品5：单味川芎40 g。
分别将上述5个样品用400 ml蒸馏水于微波快速反应仪上80℃萃取30 min，同时制作蒸馏水样为空白，萃取完后所得的溶液中先用四层纱布过滤，后用中性滤纸滤除溶液中的微小残渣，再经减压蒸馏（70℃）除掉大部分水分后，把溶液小心转移至50 ml容量瓶中，用1%的硝酸溶液稀释至刻度待用，同时用稀释液清洗减压瓶。测量钙、镁时从中取5 ml，加入钙镁稀释剂至100 ml，使测试液稀释20倍后测量。在测试过程中，如果某种元素的吸光度比较高，高于线性范围时采取加稀释液稀释的办法，使其吸光度值在线性范围内。
2.3 标准方程建立依据所配制的标准溶液，按原子吸收仪器操作步骤对仪器进行设置，除zn元素的燃气流量改为1 500 ml·min-1，其他参数均为系统提供的专家数据，实验过程中仪器参数及工作方程见表2。表2 6种元素测定时的标准方程和相关系数（略）
2.4 检测结果根据上述方法，把所测样品中金属元素的含量乘以稀释倍数再除以样品重，得每克样品中所含元素的质量，所检测的四物汤及其单味药样品中6种金属元素的含量。见表3。表3 四物汤及其单味药中6种金属元素的含量 （略）
3 结论
从表1中可以看出，四物汤的单味药提取液中金属元素含量各不相同，其中含fe和ca最多的为熟地，含cu和mn最多的是川芎，含zn和mg最多的是当归，而白芍中除了ca元素外，fe，cu，zn，mn，mg 5种元素的含量是最低的。四物汤由于是四味药的复方，所检测的6种金属元素含量都相对较高。这些金属元素的存在及其含量与其补血功能之间存在一定的关系，与文献［2］报道的四物汤单味药物的补血效果低于复方药的综合效果相一致。
已知人体内有超过50%的酶的活性与金属元素的存在有关。人体缺铁、缺铜和缺锌都会造成贫血，四物汤水提取液中除有机化合物在补血方面有充分的作用外，其含有的金属元素所起的作用也不容忽视。但人体的金属元素含量也并不是越多越好，现代医学研究表明，过量的铁、铅、锌、锰、钙和镁等会造成元素中毒，而四物汤中各种元素的含量正好扬长避短，使其整体的金属元素含量对于人体不过量。
本方法检测快速准确，适宜中药中元素含量的测定。
【参考文献】
关键词：回心草；总黄酮；微量元素
中图分类号：R 282，71
文献标识码：A
文章编号：0367-6358(2007)12-713-03
作者简介：董顺福(1963－)，男，学士。教授，主要从事化学光谱分析及中药有效成份的研究。
回心草产于滇西北地区的云南丽江玉龙雪山上。生长的潮湿林地或湿润的岩石及石缝中，具有安神镇静、治心慌、心悸等心脑血管疾病，含有邻苯二甲酸二丁酯、对聚伞花素及微量元素等多种化学成分。现代研究表明，微量元素和总黄酮与人体的生物功能具有密切的关系，为研究中药回心草中微量元素和总黄酮的分析方法及其含量与治疗心脑血管疾病的关系，本文采用紫外分光光度法测定了回心草中总黄酮的含量，用原子吸收分光光度法测定了Mg、Fe、Mn、cu、zII 5种矿物元素的含量。对微量元素和总黄酮与治疗心脑血管疾病的关系进行了系统的分析研究。
1 金属元素含量的测定
1.1材料和试剂
回心草，采自云南地产中草药。
HN03，HCIo4均为优级纯。
标准储备液，Mg、Fe、cu、Zn均为国家标准溶液(NCS)，浓度为1mg／mL，国家钢铁材料测试中心，Mn储备液浓度为0，5 mg／mL，中国环境检测总站。使用液浓度：Mg为100g／mL；Fe、cu、zn均为50g/mL;Mn为20g/mL。去离子高纯水(电阻率为106Ω／cm)。
1.2仪器及仪器工作条件
HC-9006型原子吸收分光光度计，附80586计算机及FAAS软件处理系统。
原子吸收分光光度计仪器工作条件见表1。
1.3样品处理
随机取干燥样品100 g，研碎。充分混匀，准确称取1，000 g。平行称取3份，于25 mL锥形瓶中，加浓HN010 mL，密封过夜，次日加浓HN03 10 mL，HC1045mL，置电热板上缓慢加热消化，至溶液呈无色透明，近千为止。冷却后，转移至25 mL容量瓶中，用4％I-HNO3定容至刻度，混匀备用。
1.4标准溶液
各元素标准系列工作液见表2。
按仪器最佳工作条件分别测定各标准系列工作液。由计算机绘出标准曲线，算出回归方程和相关系数。在本工作范围内，各元素线性关系良好。
1.5样品含量测定
按表1所列仪器最佳工作条件：用火焰原子分光光度法吸收法测定样品溶液中cu、zn、Mn的含量，测定Mg、Fe时需将样品稀释10倍后再行测定。Mg的测定加10％的LA(No)，可排除ca、K、Na等的干扰。
回心草中Mg、Fe、Mn、cu、zn元素的回归方程、相关系数和含量测定结果见表3。
2 总黄酮的测定
2.1乙醇提取回心草中总黄酮
准确称取中药回心草10，0g于索氏提取器中，120mL乙醇回流4h，至无色，换成70％乙醇提取10h，过滤，减压浓缩至20mL左右，等体积石油醚萃取，用70％乙醇定容至100 mL，在200―400 nm波长范围内紫外扫描，最大吸收波长为284nm。
2.2标准曲线绘制
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品(F20060930，国药集团化学试剂有限公司)0，0760 g，用30％乙醇溶解后，转移至250mL容量瓶中，30％乙醇定容，摇匀备用。溶液浓度为0，3040 mg／mL。准确转移上述芦丁溶液0，00、1，20、1，60、2，00 mL于25 mL锥形瓶中，加30％乙醇至12，5 mL，加入0，8 mL 5％NAN02溶液，放置5 min；加0，8 mL 5％Al(N03)3溶液，放置6 min，加5 mL 4％NaOH溶液，30％乙醇稀释至刻线，放置10 rain，紫外分光光度计于510 nm处测定吸收度，绘制标准曲线。
回归方程：A=9，250c+0，001
相关系数：r=1，000
2.3 回心草中总黄酮的测定
准确量取提取液0，50 mL于25 mL容量瓶中，加30％乙醇至12，5 mL，加入0，8 mL 5％NaNO，溶液，放置5 rain，加0，8 mL 5％Al(No)溶液，放置6mln，加5 mL 4％NaOH溶液，30％乙醇稀释至刻线，放置10 rain，于510 nm处测定吸收度A=0，159。总黄酮含量为4，316±0，076mg，g，RSD％=1，77％。
3 讨论
研究表明回心草具有安神镇静，治疗心慌、心悸等心脏疾病的功效，长期服用可以起到疏通血管，软化血管，使血管恢复弹性，改善血液循环的作用。黄酮类化合物是中草药中的重要的天然产物，是中草药中的有效成分，天然来源的生物黄酮能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障进入脂肪组织，消除疲劳，保护血管，防止动脉硬化。能使超氧化物岐化酶(SOD)活性加快，提高机体抗氧化能力及对NO的降解，明显扩张微细血管，降低血管阻力，增加脑血流量，改善微循环、清除自由基的作用。
屋主似乎被两个不速之客吓坏了，他夺门而逃。萨莫斯急忙冲着屋主的背影大喊：“先生别跑!我们是来探险的，需要你的帮助，不然我们会死在这片森林里的。”屋主停下了脚步，犹豫了半天，他提出了条件：“好吧，我可以帮助你们，但你们不能告诉别人在这里见过我。”
第二天，在屋主的带领下，他们很快就接近了森林的边缘。然而，意外发生了，一条蛇袭击了他们，屋主的小腿被咬住了，经过一番缠斗，屋主终于把蛇扔了出去。萨拉斯和萨莫斯却发现了一个更加惊人的事实，屋主的伤口涌出了墨绿色的液体。这居然是绿色的血液?!
在两人的询问下，屋主将自己的故事和盘托出。屋主叫达沃・席尔瓦，曾是学校的助教，2001年，他带着学生来到这里探险。进入丛林后不久，他们就在一片沼泽的边缘发现了一些石雕，于是，他们驻扎了下来，一住就是一个月。厄运悄悄降临了，一些学生的身体逐渐虚弱，变得精神萎靡，有的人还出现了尿血的情况。学生们陆续退出了探险队伍，只有席尔瓦和学生埃利坚持了下来。一天，他们发掘出了一块手掌大小的石刻。发现石刻后仅仅过去了几天，埃利的身体开始浮肿，席尔瓦决定带着他去找医生，但还没走出丛林，埃利就停止了呼吸。席尔瓦伤心地掩埋了埃利，在挖坑时，他不小心弄伤了手，墨绿色的血液流了出来。接连受到打击的席尔瓦崩溃了，他认为，那片沼泽有着恶毒的魔力，挖掘出的石刻就是恶魔的诅咒!席尔瓦害怕被诅咒的自己再给别人带来厄运，于是便在丛林中居住下来。
萨莫斯将席尔瓦带回了自己的诊所，采集了他的血液标本。萨莫斯发现，除了颜色以外，席尔瓦的血液保留了一切人类血液的特征，但他还是无法找到血液变绿的原因。
萨拉斯和萨莫斯决定，去那片神秘的沼泽一探究竟。傍晚，沼泽里突然出现了淡淡的青蓝色烟雾，烟雾悬在沼泽上空1米多高的地方，任凭风怎么吹也不会散开。见状，萨莫斯采集了烟雾的样本带回去研究。烟雾样本被送到化学实验室进行分析，结论是：青蓝色烟雾是因为沼泽沉积物的物理反应造成的，没有特殊之处。席尔瓦更加确定这是诅咒，他要求再次返回丛林。
萨拉斯仔细研究了实验报告，发现席尔瓦的血液中钒元素含量偏高，而烟雾中的钒成分也超标!萨拉斯和萨莫斯来到了墨西哥国立自治大学，利用小白鼠进行实验：每天给小白鼠注射一些富含钒元素的钒盐溶液。一周之后，小白鼠的血液变成了墨绿色!
【摘要】 为了比较大鼠胎血和骨髓中非造血成体干细胞（non-hematopoietic adult stem cells，NASC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同，在无菌条件下采集孕大鼠的胎血和成年大鼠的骨髓，用Ficoll-hypague分离液分离出单个核细胞（MNC）后，种植于含10%胎牛血清的DMEM/LG培养液内。收获的NASC传代培养，用流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇（β-ME）、二甲亚砜（DMSO）和叔丁基对羟基茴香醚（BHA）诱导NASC向神经元分化，用免疫细胞化学染色检测其特异性标志巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果发现: 传代培养后的两种NASC的形态相似，皆呈均一的梭形；流式细胞仪检测结果示两种NASC的免疫表型无明显差异，表达CD44、 CD54，不表达CD11b、CD45；定向诱导的两种NASC具典型神经元形态，免疫细胞化学染色显示nestin和NSE为阳性，但GFAP为阴性。结论：大鼠胎血和骨髓非造血成体干细胞的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者都可被诱导分化为神经元样细胞；胎血应是NASC的又一来源。
【关键词】 成体干细胞；非造血成体干细胞；胎血；骨髓；细胞生物学；神经元样细胞
Differentiating Ability of Non-hematopoietic Adult Stem Cells from Rat Fetal Blood and Bone Marrow In Vitro
Abstract
To compare the growth characteristics of non-hematopoietic adult stem cells (NASC) derived from rat fetal blood and rat bone marrow in vitro， and to study the differentiation of these stem cells into neuron-like cells in vitro，the fetal blood of pregnant rats and bone marrow of adult rats were sterilely collected; mononuclear cells (MNC) were isolated by using standard Ficoll-hypague techniques and then cultured in DMEM/LG containing 10% fetal bovine serum (FBS). The acquired NASCs were subcultured for passage. The immunophenotype of NASCs was detected by flow cytometry. The expanded NASCs were induced to differentiate into neurons-like cells by β-mercaptoethanol (β-ME)， dimethylsulfoxide (DMSO)，butylated hydroxyanisole (BHA). The specific markers of these neuron-like cells were detected by immunocytochemistry. The results showed that two kinds of subcultured NASCs showed homogeneous spindle-shaped and expressed antigens CD44 and CD54，but did not expressed CD11b and CD45. The both induced cells were similar to neuron in morphology and were positive for nestin and neuron-specific enolase (NSE)，but negative for glial fibrillary acidic protein (GFAP). It is concluded that no significant difference of NASCs derived from pregenant rate fetal blood and adult rat bone marrow found in cell morphology and biological characteristics. NASCs of both origins can be induced to differentiate into neuron-like cells，so fetal blood can be regarded as another resource of NASC.
Key words adult stem cell；non-hematopoietic stem cell； fetal blood; bone marrow; cell biology; neuron like cell
非造血成体干细胞（non-hematopoietic stem cell，NASC）是骨髓中除造血干细胞外的来自各胚层的成体干细胞，包括具有CD34-及贴壁生长特点的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、心肌干细胞、神经干细胞等。在适宜的信号刺激下NASC能够被诱导分化成不同的骨髓微环境组成成分，如成骨细胞、 脂肪细胞和基质细胞，也能分化为神经细胞［1］、 肝细胞等。最近有学者已证实了人脐血也能分离培养出NASC，后者可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞及肝细胞等分化［2］。相对于骨髓NASC来讲，脐血的来源丰富，收集方法简便易行，微生物和肿瘤细胞污染的可能性比较小，避免了自体髂骨穿刺获取骨髓的局限性。因此，脐血NASC作为一种新来源，用于细胞工程研究具有广阔的前景。我们分离培养大鼠胎血和骨髓NASC，观察比较两者生长特性及向神经元样细胞的分化能力有何异同。
材料和方法
动物与试剂
20只孕20天的Wistar大鼠、15只健康成年Wistar大鼠（雌雄不限）均购于山东大学实验动物中心，DMED/LG培养液、胎牛血清（FBS）购于Gibco公司，β-甘油磷酸、异丙基甲基黄嘌呤、β-巯基乙醇（β-ME）、二甲亚砜（DMSO）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）购于Sigma公司，FITC标记的小鼠抗大鼠CD11b、CD44、 CD54、 CD45单克隆抗体及小鼠IgG1单克隆抗体购于SEROTEC公司，兔抗大鼠GFAP、nestin、NSE抗体及免疫组织化学试剂盒购于Boster公司。
胎血NASC分离培养
无菌条件下，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg使孕鼠麻醉后，剖腹取胎鼠，剪断其颈部吸取断面血液，剪开胸腔抽取其心脏中血液至含肝素30 U/ml的DMEM/LG 培养液中。密度梯度离心法收获MNC，PBS洗涤2次，按1×108 cells/cm2的细胞密度接种于培养瓶中，培养液为含10% FBS、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的DMEM/LG，将培养瓶置于37℃、饱和湿度的5% CO2培养箱中培养。1周后首次换液，每周换液2次。当细胞融合达70%-80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。
骨髓NASC分离
过量麻醉处死大鼠，无菌条件下取出股骨、胫骨，用含肝素30 U/ml的DMEM/LG 培养液反复冲洗骨髓腔，获得骨髓冲洗液后离心、种植培养方法同上述胎血。
NASC的免疫表型检测
分别取扩增3、6代的胎血和骨髓NASC，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，再用含10% FBS的PBS洗涤，制成浓度为1×106 cells/ml的单细胞悬液。分别加入 10 μl FITC 标记的小鼠抗大鼠CD11b、CD44、CD54、CD45单抗，阴性对照加入小鼠IgG1-FITC，避光室温孵育30分钟，PBS洗涤，流式细胞仪检测。
NASC诱导分化成成骨细胞
选第5代胎血和骨髓NASC，培养体系为含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和0.2 mmol/L抗坏血酸（美国Sigma公司）的DMEM。每周换液2次。在2周左右两者均可以形成成骨细胞，用茜素红染色，可见细胞浆中有大量的钙沉积。碱性磷酸酶染色呈阳性。
NASC诱导分化成脂肪细胞
选第五代胎血和骨髓NASC，诱导分化剂由1 μmol/L氢化考的松、0.5 mmol/L异丙基甲基黄嘌呤、0.1 mmol/L消炎痛和10％兔血清组成，培养液仍为DMEM，3-4天换液1次，在20天左右两者均可以形成脂肪细胞，进行油红染色，可见细胞浆内充满了油滴空泡。
诱导NASC向神经元样细胞分化及鉴定
定向诱导
分别取第5代胎血和骨髓NASC，以5×103 cells/cm2浓度接种于铺有载玻片的6孔板中制备细胞爬片。将细胞爬片随机分为实验组和对照组。实验组采取两步诱导法：先用含10% FBS、5 mmol/L β-ME的 DMEM/LG诱导1天后换为含10% FBS，2% DMSO，2 μmol/L BHA的DMEM/LG诱导1天。对照组仅用含10% FBS的DMEM/LG培养，不添加任何诱导剂。倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。
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免疫细胞化学鉴定
细胞爬片经PBS洗涤后用冷丙酮固定，在H2O2与甲醇1∶50混合溶液中室温封闭去除内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液孵育，再滴加兔抗大鼠nestin、NSE、GFAP抗体，4℃过夜，生物素化山羊抗兔IgG 37℃孵育20分钟，再与链酶亲和素-过氧化物酶（SABC）反应20分钟，DAB显色，苏木素复染。阴性对照用PBS代替抗体，实验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。
结果
NASC的生长特性
镜下观察，胎血贴壁细胞生长较快，原代培养7天时大部分呈纤维样束状排列，有少量圆形细胞成团或单个散在（图1）。大约10天时细胞达70%-80%融合首次传代。从第3代之后，视野中为形态均一的梭形细胞。这些细胞增殖一代约需4-8天，8代以内保持较快增长速度。骨髓细胞成分复杂，原代培养7天时贴壁细胞形态不均一，呈三角形、锥形或蝌蚪状，也有部分圆形细胞存在。约2周细胞首次传代，第3代以后呈均一的成纤维状，增殖速度与胎血MASC相似。
NASC免疫表型
流式细胞仪检测显示第3、6代NASC均表达CD44、 CD54，不表达CD11b、CD45。
NASC向神经元样细胞分化的形态变化及鉴定
β-ME诱导胎血NASC 7小时后原来的部分长梭形细胞开始缩短，胞体呈类圆形，且周围有多个不规则突起。换为DMSO、BHA后，胞体进一步收缩，约50%-60%细胞变为双极、多极和锥形，出现类似神经元的形态，有些细胞突起细长类似神经元的树突。β-ME诱导骨髓NASC 12小时后细胞形态明显改变，胞体收缩变圆，立体感增强，有突起长出，随后突起逐渐增多；换为DMSO、BHA后，细胞间突起相互连接，其胞体收缩成锥形、三角形或不规则形，折光性强，细胞伸出较多的细长突起，有的还有1-2级分支。对照组细胞形态无变化（图2）。
免疫细胞化学鉴定结果显示：β-ME诱导24小时以内，胎血和骨髓NASC均已开始表达Nestin，而NSE、GFAP不表达。DMSO、BHA诱导1天后，NSE也呈阳性表达，阳性细胞胞浆呈棕黄色，GFAP始终阴性。未诱导细胞均不表达Nestin、NSE、GFAP。分别计算两种NASC分化后Nestin、NSE阳性率（显微镜下记数300个细胞中Nestin、NSE阳性细胞数而所得的百分比），经统计学分析差异无显著性。
讨论
随着NASC研究的深入，已有不少来源于成人骨髓外NASC的报道，如脐血、外周血、胎儿骨髓、脂肪和肌肉的NASC等。Goodwin等［3］报道，从脐血分离的CD34-及贴壁生长的细胞具多系分化能力，可分别表达成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞的标志。
本研究结果表明，妊娠大鼠的胎血与成年大鼠的骨髓NASC生长特性相似，随着传代次数增加细胞逐渐纯化，呈形态一致的梭形，且增殖能力相同。只是在原代培养的初期，两种贴壁细胞形态和成分略有不同，骨髓细胞更为复杂。两种NASC的表面抗原表型一致，CD54、CD44阳性，但不表达各细胞系标记如CD34、CD11b和CD45。CD54是细胞间黏附分子，CD44是归巢相关黏附因子，CD11b为NK细胞、粒细胞、单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞的表面抗原，CD45为所有白细胞共同抗原。这说明胎血NASC与骨髓的一样，是源于非造血细胞的一类抗原稳定未分化的干细胞。
研究还发现，在相同的诱导条件下，妊娠大鼠的胎血与成年大鼠的骨髓NASC向神经元分化过程中形态变化不完全一致，但共同特点是细胞胞体缩短变圆有细长的多个突起，具有典型神经元的形态。我们认为，形态学不一致可能与诱导前细胞自身状态及来源不同有关，以至分化后形态变化不尽相同，这不足以说明两者分化能力和特性不同。应该以分化细胞是否表达神经元标志物来判断。免疫细胞化学染色显示：β-ME诱导24小时以内，胎血和骨髓NASC均已开始表达nestin，而DMSO、BHA诱导1天后，NSE也呈阳性，GFAP始终为阴性。统计学分析妊娠大鼠胎血与成年大鼠骨髓NASC分化后nestin、NSE阳性率无显著性差异，说明两者向神经元样细胞分化的能力相同。nestin是一种神经元中间丝蛋白，为神经干细胞特异标志物，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，其表达逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止。当神经元发育成熟时表达NSE，它是γ-γ糖酵解酶的同工酶，存在于神经元胞浆中。GFAP属细胞骨骼蛋白，是星形胶质细胞标志物。上述研究提示，NASC经诱导后首先分化为神经干细胞，然后向成熟的神经元分化，但不分化为星形胶质细胞。诱导剂β-ME、BHA有强抗氧化作用，已知在β-ME的作用下，细胞形态由梭形收缩成圆形、近圆形，这可能与其改变细胞氧化状态有关；β-ME能保护神经细胞的存活，促进轴突的显著增长，促进谷胱甘肽合成，清除氧自由基，但其具体作用机制尚待进一步研究。
NASC对不同的诱导因子反应不同，即使同种诱导剂，浓度及作用时间的差异也会引起NASC的反应各异，这导致了有些研究结果不甚一致。经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、DMSO、BHA诱导后，大部分NASC分化为神经元，而在bFGF、脑源神经营养因子(BDNF)的作用下，部分分化为神经胶质样细胞［4］。以全反式维甲酸、β-ME、cAMP 、bFGF、BDNF等作为诱导剂，经诱导的NASC中有69%细胞形态学上呈现神经胶质细胞的形态，有轴突样结构突起，且随诱导时间胶质细胞标志物的表达逐渐增多［2］。应用BDNF、NFκB受体活化子配体(RANKL)能诱导NASC同时向神经元和星形胶质细胞分化，且两者联合应用比单独应用时细胞分化率高［5］。因此，探讨诱导剂的最佳浓度、最佳组合及提高NASC分化率仍是需要研究者共同努力解决的重要问题。
本实验不仅说明了妊娠大鼠胎血与成年大鼠骨髓NASC都具有自我增殖的特性，而且被诱导分化为神经元样细胞的能力相同。作为干细胞的来源，人类脐血来源广泛、容易获得、免疫源性低等优点是骨髓无法相比的，这为今后人脐血NASC移植治疗神经系统疾病提供了动物实验依据。
参考文献
1 Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res，2000；61: 364-370
2 Lee OK，Kuo TK，Chen WM，et al. Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical blood. Blood，2004；103: 1669-1675
3 Goodwin H，Bicknese AR，Chien SN， et al. Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood:expression of bone，fat and neural markers. Biol Blood Marrow Transplant，2001；7: 581-588
【关键词】铊中毒；血液净化
铊是一种金属元素，广泛应用于光化学、水泥、摄影产品、低档珠宝首饰，铊金属几乎没有毒性，但是铊盐，毒性剧烈，以往研究报道对于铊中毒的患者主要采用药物排泄毒物[1]，近年有学者提倡早期血液净化治疗[2]。本科室自2009年3月至2011年3月进行铊中毒血液净化治疗患者3例，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 3例患者中男1例，女2例，年龄分别为24岁、56岁、65岁，在中毒8～12 d入院。
1.2 症状 1例表现为呼吸困难、胸闷、胸痛、心悸气短和循环症状，1例表现为肢体末端麻木，烧灼样疼痛等周围神经症状，1例表现为恶心呕吐、腹胀腹痛、咽喉痛。
1.3 实验室检查 白细胞升高1例，红细胞降低1例，血小板升高2例，尿蛋白增多1例，血钾降低3例，凝血异常1例，肌酐、尿素氮升高1例，治疗前3例患者均抽血1 ml，留取24 h尿标本，送检，用原子吸收光谱法[3]测定血、尿铊浓度。3名患者血、尿铊明显升高，血铊浓度平均746.6 μg/L（532～1109 μg/L），尿铊平均7421.3 μg/L（2609.3～11290.7 μg/L），确诊为铊中毒。
1.4 治疗
1.4.1 综合治疗 3例患者确诊后立即给予洗胃、导泻、利尿保肝、肾功能、营养心肌、补钾和B族维生素和神经生长因子改善神经功能。普鲁士蓝250 mg/kg，每次溶于20%甘露醇10 ml中口服，3次/d。
1.4.2 血液净化治疗 3名患者确诊后局麻下行右侧股静脉临时导管置入，术后根据患者的情况使用透析机，透析液流速在500 ml/min，同时低分子肝素钙抗凝治疗，一个灌流器灌流时间在2～2.5 h，治疗过程中给予心电监护，密切观察患者的生命体征，治疗前后取血、尿标本送检。
2 结果
经过3～10次血液净化治疗，3例患者血、尿铊浓度下降明显，血、尿铊浓度基本接近正常，停止治疗，治疗过程中未发生其他副作用。3例患者出院时临床症状明显减轻，肝肾功、心肌酶谱恢复正常，神经系统查体均阴性表现。
3 结论
铊中毒主要经消化道、皮肤和呼吸道，接触后可以很快吸收，胃肠道反应和神经系统症状、脱发是铊中毒的主要临床表现，但患者也可由心血管系统、免疫系统症状。铊中毒对儿童的致死量为5～7.5 mg/kg，12 mg/kg即可导致成人死亡[4]。 铊元素和钾元素屋里和化学性相似，常在机体内一起聚集，如在神经系统、肌肉和肝脏等系统，作用于上述组织的Na+-K+-ATP酶，引起胃肠道反应，周围神经症状，肌肉酸痛等。铊元素与核黄素结合可以导致能量代谢障碍；与巯基结合，抑制细胞氧化磷酸化，干扰能量代谢；与半胱氨酸结合，一起皮肤病变和脱发[5]。临床研究表明[6]，铊中毒患者如果出现胸闷、气短、呼吸困难和既往有脏器疾病史则预后不良。
铊中毒的诊断主要依靠铊浓度检测的结果，但是，早期的临床症状特征对于早期诊断非常重要，口服普鲁士蓝、导泻、补钾等是治疗的基础，普鲁士蓝上的钾离子可以置换出经胃肠道的铊元素，形成不容物质，减少铊的吸收。补钾有利于增加尿中铊的排出，钾离子浓度的增高可以增强钾离子和细胞内铊离子的交换，使铊离子游离出细胞内，利于从肾脏排泄， 但补钾一定要谨慎，因如补钾量太大会造成细胞内的铊置换入血循环过多，导致患者病情加重，因此，用药期间要检测患者的血钾。
铊中毒因发病率极低，起始症状缺乏特异性，因此医师提高对其警惕性非常重要，本研究表明，血液净化治疗在治疗铊中毒方面有着明显的优越性，起效迅速，安全性高，值得临床推广。
参 考 文 献
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【关键词】瘀血;活血化瘀;妇科
【中图分类号】R271 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)09-0156-01
“瘀血学说”及其“活血化瘀法”的形成和发展己有两千年的历史。目前,无论在理论还是实践方面,都具有极其丰富的内容,已达到完整化、系统化程度,然而,随着近年中医实验研究的出现并日臻完善,以及现代医学中生物化学及细胞分子生物学的发展,人们试图从微观角度阐明活血化瘀法治疗瘀血证的作用机理,从而为临床运用活血化疲法提供依据。综合分析近年来的研究结果,活血化瘀法具有如下作用:
1 改善微循环
大量实验已证实,经活血化瘀治疗后可明显改善毛细血管脆性,增加微循环毛细血管张力,降低毛细血管壁的通透性,并有稳定毛细血管内皮细胞和抗氧化作用,不同程度地解除微循环障碍从而改善微循环功能。另有研究发现少腹逐瘀汤能明显改善子宫内膜血循环,增加血流量,治疗继发性不孕症有一定疗效。
2 改善血小板功能、改变血液流变学性质
PGI2和TXA2在调节血小板聚集中是一对矛盾,TXA2/PGI2的平衡维持着血液的正常状态。研究发现,许多活血化瘀药能减少TXA2合成,从而起到抑制血小板聚集、粘着、降低血小板的表面活性,促进己形成的纤维蛋白溶解,防止微血栓形成。如马民等动物实验研究发现活血化疲中药红花、当归、赤芍、丹参等均有增强纤维蛋白溶解,减少血小板聚集、粘附作用。此外,活血化瘀药物还能改善血液的“浓、粘、凝、聚”的倾向,从而改善血液流变学的性质。
3 抗炎、促进组织的修复与再生
使用活血化瘀法后,血液流变性质改善,血流加快,红细胞解聚,毛细血管网开放增多,在局部血流增加的基础上,加快了坏死组织的吸收,改善了血液的供给和营养,从而促进组织的修复与再生,因此对妇科各种炎症均具有较好治疗作用。如贾素梅研究发现,水蛭等活血化瘀药物中含多种蛋白水解酶及抗凝血酶原激酶的作用。此外,还能分泌一种组胺样物质,可扩张毛细血管,对改善血流变性质,减少炎症细胞浸润,抑制炎症介质产生,增强吞噬细胞功能具有明显作用。
4 促进增生性病变的转化和吸收
实验研究表明,活血化瘀药物能减少胶原纤维的合成,减轻组织的增殖,松解粘连,软化瘫痕,促进病理增生组织的分解和创伤组织的修复。如刘毅报导大黄虫丸能明显降低胶原蛋白含量,减轻组织纤维化程度。
5 止痛
现代药理研究证明活血化瘀药物如当归、川芍、赤芍、丹参、元胡、乳香、没药等能降低血浆前列腺素E2、F2α及血浆β~内啡肤水平,缓解血管平滑肌痉挛,从而起到止痛作用。
6 调节免疫机能
现代医学证实,妇科疾病中许多病症都与免疫功能失调有关。如认为子宫内膜异位症是由于机体免疫功能异常,免疫防御机能下降使子宫内膜逆流入盆腔种植而致。母儿血型不合性不孕是由于存在免疫排斥反应而致胎儿流产。有学者通过对比研究证实盆腔瘀血综合征患者的部分免疫功能细胞(CD3、CD4、CD8)百分率、IL-2膜受体与NK细胞百分率和正常人比有明显差异,因而提示盆腔瘀血综合征与免疫功能紊乱有关。大量药理研究证明许多活血化疲药对机体免疫功能具有双向调节作用。如红花能增加小鼠免疫器官的重量,增高免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)及脾淋巴细胞转换率,从而促进小鼠细胞免疫和体液免疫;当归能增加血液、胸腺中cGMP含量,从而促进巨噬细胞吞噬和淋巴细胞转化等免疫功能,血府逐瘀汤能使体液免疫超常组和低下组脾抗体生成细胞恢复到正常水平。
7 调节内分泌
韩桂如等在临床观察中发现血瘀为高泌乳素血症的主要病因病机,活血化瘀能有效降低PRL,使下丘脑一垂体一卵巢轴功能得到调整,从而也证实了妇科血瘀与调节轴功能障碍有密切联系,沈坚华等发现活血化瘀法能明显改善不孕患者黄体功能不全状态。此外,活血化疲法通过调节血液微循环,可改善子宫内膜的营养状况,有利于卵泡发育,并促使卵泡破裂,具有溶解某些酶和增高卵泡内压力作用,有助于精卵结合和受精卵着床。动物实验研究发现活血化瘀药能明显增加未成年大鼠子宫重量和外周血雌二醇水平,对卵巢功能有一定促进作用。另外,又能降低PGE2含量,提高PGF2含量,而PGF2有促进卵泡成熟和促排卵作用,也为中药人工周期在排卵期使用活血化瘀药提供了实验依据。
8 调节血清微量元素含量
现代医学证实微量元素对女性生理、病理方面具有重要影响,它参与人体内分泌功能、酶系统、糖,蛋白质代谢和免疫功能等。若Zn含量降低,影响垂体分泌促性腺激素,减退,月经失调;Cu含量低与习惯性流产,不孕症等疾病有关。活血化瘀药物如丹参、桃仁、水蛭、乳香、没药等具有丰富的Zn、Cu等元素,能明显提高这些微量元素的含量。
9 催产作用
某些活血化瘀药在促进血行,消散瘀滞的同时兼有催产、下胎作用。实验研究证实,益母草对子宫具有麦角新碱样作用,可增强子宫收缩力,增加收缩频率。动物实验显示川芍浸膏,红花浸膏对家兔子宫均有兴奋作用,能使子宫发生紧张性或节律性收缩,当归能兴奋子宫平滑肌上的H1和α受体,如与人参协同作用可直接或反射性地使脑垂体后叶分泌催产素,刺激蜕膜释放前列腺素,使宫颈软化、变短、扩张而成熟。此外,有文献报道丹参、川芍臻能通过改善胎盘血液供应而促进宫内发育迟缓的胎儿生长,这在一定程度上可改善宫内环境,减少胎儿窘迫的发生。
10 抗肿瘤作用
妇科肿瘤在祖国医学中属“”“积”范畴。《内经》云:“坚者消之,结者散之,瘀者通之”。现代医学证实肿瘤患者的血液流变学表现为高凝、高粘状态,并有外周微循环障碍,血瘀症与肿瘤密切相关,活血化瘀法在抗肿瘤研究中具有重要地位,其作用机理主要在于直接的细胞毒作用;抗突变作用;抑制肿瘤细胞增殖,诱导分化与调亡作用;减弱血小板凝集,使肿瘤细胞不易在血中停留、粘附、聚集、种植,从而减少转移;能影响微循环,增加血管通透性,以改善瘤组织局部的缺氧状态,提高放、化疗敏感性;提高抗体、补体水平,增强机体免疫力;抑制纤维母细胞亢进的胶原合成,预防或减少放疗引起的组织纤维化,调节基因表达,抑制原癌基因表达而促进抑癌基因表达。
参考文献
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关键词：含朱砂中成药；微量元素；含量分析
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0206-03
Determination And Analysis of Trace Elements in Five Different Chinese Traditional Patent Medicines Containing Vermilion
JIN Qianxing1, DAI Xiaoyan2, HAO Yunyun2，WU Qiaofeng2
(1.First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, Zhejiang, China;
2.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang, China)
Abstract:Objective: To determine the trace elements content in different Chinese traditional patent medicines containing vermilion. Method: After wet digestion, trace element contents of four samples were respectively determined by ICP-OES. Result: These medicines (Bozi Yangxinwan, Tianwang Buxinwan, Qili Jiaonang and Bushen Yinaowan) all contain Co, Cr, Cu, Mn, Fe, As, Zn, Tl, Cd, B, Hg and Pb. Hg element contents of these medicines were all out of limits. Qili Jiaonang has the highest Fe, Mn, Zn, B, Cr, Co content; Cu content of BuShen Yinaowan was slightly out of limit. Conclusion: The dose of these Chinese traditional patent medicines containing vermilion should be controlled and the curative effects of them may have relationship with the trace elements.
Key words:Chinese traditional patent medicines containing vermilion; trace elements;content analysis
朱砂具清心安神的功效，常与补心养血的中药相配伍，含朱砂的中药制剂一直以来在临床上广泛运用，尤其针对一些疑难杂症有特殊疗效[1]。近年来大量研究表明，中成药的药效发挥不仅与有机成分有关，而且与其含有的微量元素的协同作用关系密切[2-4]。微量元素的测定结果分析可为含矿物类中成药的临床应用提供可靠的理论依据[5]。朱砂主要成分为硫化汞，在《中华人民共和国药典》2010版一部收载的46种含朱砂中成药制剂中有44种为口服制剂，关于含朱砂中成药中微量元素的含量问题长久以来受到关注[6]。
中药中微量元素的检测方法常用的有分光光度法、原子吸收光谱法、荧光分析法、质谱法、毛细管电泳法及电感耦合等离子发射光谱法(ICP-OES)等[7]，但有些方法因操作繁琐，对灯源的要求较高，且对于一些痕量元素无法测定而受到应用限制。电感耦合等离子发射光谱(ICP-OES)因具有灵敏度高、选择性好、精密度高、分析速度快等优点，近年来被广泛应用于微量元素分析[8]。本文拟采用ICP-OES法，对柏子养心丸、天王补心丸、补肾益脑丸、七厘胶囊等4种含朱砂中成药中的Co、Cr、Cu、Mn、Fe等12种微量元素进行含量测定，以期初步探讨含朱砂类中成药中微量元素与疗效的内在联系，旨在为含重金属矿物类中成药的临床应用和质量控制提供理论依据。
1 仪器与试药
1.1 试药
柏子养心丸(吉林龙鑫药业有限公司，批号Z22020168)；天王补心丸(河南省宛西制药股份有限公司，批号Z41021822)；补肾益脑丸(牡丹江灵泰药业股份有限公司Z20025764)；七厘胶囊(华颐药业有限公司Z10940041)。
单元素标准储备液浓度均为100 μg/mL，均购自Merck公司，批号HC825498。所用试剂均为优级纯，实验用水为超纯水。
1.2 仪器
BS110S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，Milli-Q型超纯水系统(Millipore，Bedford MA)，IRIS/AP型电感耦合等离子体发射光谱仪(美国Thermo Jarrell Ash公司)，自动回流消化仪(重庆南岸玻璃仪器厂)。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
分别精密称取4种中成药 3份，每份 0.5 g精密称定，置50 mL 凯氏烧瓶中，加入8.0mL消化液[V(HNO3)∶V(HClO4) = 4∶1]，静置过夜，于全自动回流消化仪中加热回流消化至无色透明，冷却，转移置50mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度[9]，摇匀，作为供试品溶液，备用。另取相同体积消化液，同法处理，作为空白溶液。
2.2 混合标准溶液的制备
分别取各单元素标准储备液适量，用5 %硝酸溶液制成混合溶液，梯度稀释，作为混合标准品溶液备用。
2.3 测定方法
2.3.1 仪器工作参数 检测器CID的低波段(265 nm) 积分时间：5 s；进样蠕动泵转速：100 r/min；进样雾化器氩气压力：28 psi；辅助气流量：1.0 L/min；高频发生器功率：1500 W；样品冲洗时间：5 s；测定波长范围：193.7~ 407.7 nm。
2.3.2 标准曲线的制作 依次将仪器的进样管插入各个浓度的混合标准品溶液中在相应波长下进行测定，以每一浓度测得的3次读数的平均值为纵坐标，相应元素标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标，作标准曲线，确定其相关系数及线性范围，结果见表1。
2.4 4种中成药微量元素含量的测定
按设定的条件对4种中成药中各微量元素进行测定，平行测定 3 次，浓度平均值由仪器自动得出后再扣除空白值，最终得各元素含量，结果见表2。
3 讨 论
上述4种中成药均为传统中药制剂，且含有的重金属矿物成分均为朱砂。由表2测定结果可知，4种中成药均含有Co、Cr、Cu、Fe、Mn、Zn、B、As、Pb、Hg、Cd和Tl等微量元素，其中Co、Cr、Fe、Mn、Zn为人体必需元素；B为植物的必需微量元素，近期研究表明，B也是人和动物所需要的微量元素[10]；As、Pb、Hg、Cd和Tl为有害重金属元素；而Cu既为人体必需元素也属于重金属元素的范畴。《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中规定各重金属元素限度为w(Hg)≤0.2 μg/g、w(Pb)≤5.0 μg/g、w(As)≤2.0 μg/g、w(Cd)≤0.3 μg/g、和w(Cu)≤20.0 μg/g，铊含量没有规定，但其成人的急性致毒量为6 μg/g[11]。4种中成药的Hg元素含量均大大超出限量标准；补肾益脑丸中Cu元素含量略超标。
微量元素能通过人体内的各类生化反应发挥作用，从而维持人体健康。Fe是机体中合成血红蛋白的催化剂，参与造血；Mn对心、脑血管有益，具有祛脂作用[12]；Cu元素对肾脏有保护作用，同时也被称为“大脑益友”，适量的铜能维持血管壁完整性，保护心脑血管[13]；Cr亦有保护心血管系统的作用[14]；Zn、B两元素均能促进DNA、RNA的合成和血红细胞的分化[10,15]；而Co可促进机体对铁的吸收，刺激机体造血[16]。七厘胶囊Fe、Mn、Zn、B、Cr、Co等元素含量均较高，且高于其他3种中成药，该药的补血、活血止痛及治疗外伤出血症等作用，除与处方中血竭、冰片等药材的有机活性成分有关外，还可能与其较高的微量元素含量有一定相关性。由表2可知，补肾益脑丸Cu元素含量相对最高，根据Cu元素对肾脏有保护作用，补肾益脑丸对肾虚引起的气血两虚、失眠健忘的疗效可能也与所含较高的Cu有关；此外，4种中成药的Fe、Mn元素含量均较高，且均具养血的功效，这4种中成药的养血功效可能与Fn、Mn两元素有一定相关性。
据报道，Hg对神经系统、运动系统、肾脏系统、心血管系统、免疫系统和生殖系统等器官体系会产生毒性效应[17]；As能抑制人体200多种酶的活力，通过干扰酶转录调控来影响多个人体系统功能[18]；Pb则可与人体和动物体内一系列蛋白质、酶和氨基酸内的官能团结合，从而干扰机体正常生理生化活动[19]；Cu过量会使血红蛋白变性，发生溶血性贫血，还会使胆汁排泄功能紊乱同时引起肝损害[13]；而Tl为高神经毒性元素，对肝、肾有损伤作用[11]。若长期摄入，重金属元素会在人体内蓄积而导致中毒症状的产生，故临床使用时要控制上述重金属超标中成药的剂量。至于这些中成药口服后其重金属元素在人体内的吸收情况如何，去除含重金属矿物后疗效是否降低等问题，仍需进一步研究其体内药物代谢过程以及重金属元素在人体内的存在形态。
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【关键词】：铬；人群；健康；方法
铬是一种常见的化学元素，它是由法国化学家于1797年发现的，至此铬元素常常以不同的用途出现在我们的生活当中。例如皮革的鞣制离不开铬元素的参与，动物皮革刚开始的材质十分的坚硬，不利于加工，当加入元素铬时整个皮革由于产生化学变化因而变得异常柔软，从而适合加工商制造各种皮制品。铬出现在食品添加剂中，像我们日常所熟知的皮冻的制作，冰激凌，酸奶等的制作都有铬元素的参与。不仅如此，医学上常用的胶囊的制作，其中一种叫做药用明胶的原料中就存在着铬元素。上诉所提及到的方方面面都离不开我们的生活，也就是说人群中的每个人几乎每天都在跟铬元素打交道。但是我们只是利用了铬元素其有利的一面，殊不知铬元素与另外一些金属元素（铜，汞，钡等）合称重金属，这类铬元素的化合价主要是六价，而且危害作用极大，研究表明六价铬极易对红细胞造成不可逆转的损伤，进入血液之后，能够快速通过红细胞表面的脂质双分子层，与具有重要运氧功能的血红蛋白结合，从而影响机体的运氧功能。对于食品方面我国相应的法规已经明确将铬元素列为检测项目，严格检测其在食品中的含量，以保证消费人群的健康。本文主要研究长期从事铬生产以及作业的工人们，进行身体各方面机能的检查，与一些健康人群同项机能进行对比。从而得出一些比较有意义的结论。
1 对象以及手段
1.1 调查对象
调查对象为四川省某铬产业技术园区员工，随机抽取长期从事铬制造的工人100名，其中男工人56名，女工人44名。这些工人的年龄大概都在35到50岁之间。对照组则是不接触铬制造的行政人员60名，其中男为35名，女为25名。年龄与上述年龄相仿。
1.2 测试指标及手段
主要有三个指标进行测定，一是尿隐血以及尿蛋白的测定；二是肝功能的测定；三是鼻腔损伤的测定。每天清晨空腹进行尿液的收集，尿液中铬的含量采用分光光度计进行测定，尿隐血，尿蛋白以及肝功能等指标通过山西医科大学附属人民医院进行检测。鼻腔的损伤情况主要通过额镜进行细致的检查。
1.3 统计分析
采用EXCELL对数据进行归纳整理。用卡方检验的方法对数据进行分析，分析标准是α=0.05。
2 结果以及分析
四川省某铬产业技术园区长期进行铬生产员工中，其尿液中铬的含量为0.18-1.12 μmol/L，平均处在0.355 μmol/L这个水平上。
对于长期不接触铬生产的企业行政员工，其尿液中铬的含量为0.11-0.15μmol/L，平均处在0.143μmol/L这个水平上。对于鼻腔的检查，长期进行铬生产员工中，鼻腔损害率达到55%，主要表现在以下几个方面，鼻粘膜损伤不完整、鼻甲肥大、鼻中隔不正以及鼻炎等情况。而对于长期不接触铬生产的企业行政员工来说，鼻腔损害率仅为10%左右。对于尿液的检测，尿隐血尿蛋白的检测，长期接触铬生产的员工中常年尿隐血、尿蛋白的比例达到21%，而对照组则低至5%左右。详细见表一：
从表一中可以发现：长期进行铬生产员工与长期不接触铬生产的企业行政员工相比，在尿隐血以及尿蛋白的数量以及鼻腔损伤数量上存在差异性显著（P0.05）。
从表一中可以发现：长期进行铬生产员工与长期不接触铬生产的企业行政员工相比，在尿隐血以及尿蛋白的数量以及肝功能异常数量上存在差异性显著（P0.05）。
讨论
铬作为一种重要的元素，存在于我们生活的方方面面，一方面其服务着我们的生活，例如我们机体需要三价铬元素的参与，某些功能才能够正常进行，机体才能进行完整的新城代谢，但是一旦缺乏，就会引起第一的铬元素缺乏症。另一方面，铬更多的应用于工业方面，其存在形式同上以六价的形式存在，其毒性之大，六价铬极易对红细胞造成不可逆转的损伤，进入血液之后，能够快速通过红细胞表面的脂质双分子层，与具有重要运氧功能的血红蛋白结合，从而影响机体的运氧功能。本文研究发现，长期进行铬生产员工与长期不接触铬生产的企业行政员工相比，在尿隐血以及尿蛋白的数量以及肝功能异常数量上存在差异性显著（P
【参考文献】：
[1] 吴锐， 姬红蓉， 沈国平. 铬对接触人群健康的影响[J]. 环境与职业医学， 2011， 28（5）：304-305.
【摘要】
目的 研究脑心清及其黄酮成分对海马神经元细胞l?型ca2+通道活性的影响。 方法 采用全细胞记录式(whole?cell model)的膜片钳技术记录海马神经细胞l?型ca2+通道电流变化。 结果 槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/ml浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞l?型钙通道电流(ica,l)峰值(p<0.01)，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%，可使ica,l 的i-v相关曲线下移，但没有电压依赖性特征，也不改变钙通道的电学特征。结论 脑心清及其黄酮成分对海马神经细胞l?型ca2+通道活性有激活增强作用，有利于神经元细胞内钙稳定，发挥抗缺血再灌注损伤的作用。
【关键词】 l 型ca2+通道 脑心清 黄酮 槲皮素 海马神经元 膜片钳技术
abstract:objective to investigate the effects of quercetin,fldk?p70 and naoxingqing (nxq) on l?type calcium channel (ltcc) in the cultured pyramidal neurons isolated from hippocampus.methods calcium currents were recorded in whole?cell patch?clamp mode with quercetin,fldk?p70 and nxq in the measurement medium.results it was found that 5.0～25.0 μg/ml of quercetin,fldk?p70 and nxq enhanced l?type calcium channel current by 61.6%,55.3%,52.0% ，respectively in the cultured neurons. significantly,the quercetin,fldk?p70 and nxq?mediated increases of calcium currents saturated at the concentrations around 100 μg/ml in the cultured neurons.conclusion these findings suggested that the l?type calcium channel in cultured pyramidal neurons could be modulated by quercetin,fldk?p70 and nxq,which might be beneficial to the intracellular calcium homeostasis in the insulted and damaged susceptible neurons under ischemia/reperfusion disorder.
key words:l?type ca2+ channels; hipocamcal pyramidal neurons; naoxinqing (nxq);flavonoids;quercetin;patch?clamp
在复杂的编码细胞内激活细胞凋亡的信号相互作用中，钙起着重要作用。通过内质网、线粒体和其他信号通路，ca2+稳态改变与启动细胞凋亡性死亡密切相关[1，2]。ca2+稳态的调节极其复杂，至今还未明了。近年来研究表明，在控制ca2+稳态的过程中更精细的变化可能对决定细胞生死有深刻影响[3]。ca2+稳态可能是凋亡的基本致病过程中的一个药理靶标。
l?型ca2+通道在海马锥体神经元基底树突和胞体都特别集中，其电流占细胞总钙电流的30%～50%。它们的开放和关闭能有效调节细胞浆内ca2+的水平，而且有证据表明它们还能将钙信号直接传至细胞核[3，4]。l?型ca2+通道的激活可以直接调控一些对神经元存活及其功能所必需的重要基因的表达，如bcl?2和脑源性神经营养因子等[5]。
脑心清(nxq)及其有效成分柿叶黄酮(fldk)都具有抗脑缺血损伤作用[6],通过上调抗氧化基因bcl?2的表达，改善神经细胞氧化还原状态，清除自由基、抗脂质过氧化等方面来发挥其抗缺氧缺血性神经损伤、抗氧化应激和抗兴奋性谷氨酸毒性神经损伤、抗急性脑缺血作用，抑制缺血再灌注引起的脑组织细胞凋亡，保护缺血再灌注引起损伤的脑组织，并能改善缺血再灌注引起损伤的脑组织神经功能[6，7]。本文研究脑心清及其黄酮成分对海马锥体神经元l?型ca2+通道活性的影响，以探讨在ca2+稳态调节方面，脑心清及其黄酮成分抗脑缺血损伤神经保护作用的机制。
1 实验材料
1.1 受试药
脑心清片用干浸膏(以下简称脑心清、nxq)，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供。
脑心清黄酮(fldk)，由脑心清经聚酰胺树脂吸附分离而得，总黄酮类含量77.35%，其中槲皮素类含量34.625%，山柰酚类含量为42.50%(hplc测定),代号fldk?p70。用2% nahco3 溶液加热到80 ℃溶解成含药25 mg/ml的热溶液。
实验所用溶液的ph均用hcl 和naoh溶液调至7.2～7.4,并用0.22 μm的滤膜过滤除去尘粒和细菌。室温保存，用时加pbs稀释至所需浓度即可。
1.2 药品与试剂
阿拉伯糖胞嘧啶、dna酶ⅰ、2?巯基乙醇、mem(modified eagle medium)合成培养基、d?hanks 平衡盐干粉、dmem培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、l?谷氨酰胺、多聚赖氨酸(mw70?150kd)均为美国hyclone公司产品。rnase a(sigma):以1 mg/ml的水溶液,经100 ℃煮沸以灭活dna酶活性后,分装冻存于-20 ℃备用。
1.3 大鼠
新生sd乳鼠,24 h龄，体质量约5.5～10 g，清洁级，合格证号：粤检证字第2003a053号，南方医科大学实验动物中心提供。
1.4 主要仪器
leica dmlfs倒置显微镜、mo?203微电极操纵器(mo?203，日本)、axopatch 200b型膜片钳放大器(美国 axon instrument)。
2 实验方法
2.1 新生乳鼠海马神经元的原代培养[4]
无菌条件下，借助于解剖显微镜，取刚出生24 h内的sd乳鼠，分离海马组织，用0.25%胰蛋白酶和0.2%脱氧核糖核酸酶pbs溶液37 ℃孵育消化20 min,并不断摇动,用3倍体积的dmem培养基分散和冲洗,消化的细胞经200目细胞筛过滤后，200×g离心5 min,用血球计数板计数细胞,0. 4%台盼蓝镜检存活率大于95%，以1.5 × 105个/ml的密度种植于涂有多聚赖氨酸(10 μg/ml)的24孔培养皿内,每孔0.4 ml,完全培养基为45% dmem+45% f12+10%胎牛血清的混合液,内含青霉素(100 iu/ml)和链霉素100 μg/ml。正常糖培养液： 含5 mmol/l葡萄糖的完全培养基。在一定湿度的37 ℃恒温的培养箱(5%co2)培养48 h，换培养基去除死细胞，加入终质量浓度为10 μg/ml的阿糖胞苷培养48 h，抑制非神经元细胞生长。然后隔48 h换半量新培养基，继续培养12 d，进行钙通道活性测定。
2.2 膜片钳技术测定海马神经细胞l?型ca2+通道电流[8]
2.2.1 l?型钙通道全细胞钙电流记录的液体配制 细胞浴液(mmol/l)：choline chloride 75; tea?cl(氯化四乙铵，tetraethyl ammonium tea)50;bacl2 5; cscl 5;hepes 10; mgcl2·6h2o 2;d?glucose 10;ttx(河豚毒素，tetrodotoxin) 0.001。用tea?cl调ph 至7.3。电极冲灌液(mmol/l)：csmeth 145; tea?cl 10; egta 10;mgcl2·6h2o 5;hepes 10; cacl2·2h2o 1;mg?atp 5;leupitin 0.1;用csoh调ph 至7.3，过滤除菌，避光保存。
2.2.2 记录用玻璃微电极的制作 用无芯硬质玻璃毛细管坯(gg?15，中科院上海生理所)在垂直微电极拉制仪(p?97拉制器)上用两步法拉制。在其尖端涂布n?trimethyl?silydiethylamine，并进行热抛光。电极尖端直径约为1 μm，内灌电极液后，全细胞记录的电极冲灌电极液后入细胞浴液的电极电阻在2～5 mω为佳;内插泛极化氯化银与膜片钳放大器探头相连。
2.2.3 全细胞式膜片钳记录[10] 将载有海马神经元的载玻片从培养板中取出,在每次实验前均用记录浴槽内的溶液冲洗带有神经细胞的载玻片，以洗去细胞表面上的其他成分，然后置于含有培养液的膜片钳测定专用平台液槽中，加1 ml浴液，实验仅选用状态优良的锥体细胞(贴壁良好、有明显突起、细胞边界清昕、胞浆均匀一致)。
在显微镜下找到优良的单个神经元细胞，通过倒置显微镜和微电极操纵器监视，驱动微电极接近细胞。当微电极尖端刚刚接触到细胞时，稍加负压，使之与细胞膜形成高达10 gω以上的高阻密封即刻形成。
在贴附式基础上，实验中仅选用密封电阻大于5 gω的细胞。再施以负压吸破细胞膜，形成全细胞记录状态,根据需要对串联电阻和电容进行补偿，再进行记录即为全细胞记录[10]。用l?型钙通道特异性阻断剂硝苯地平(nifedipine)和开通剂bay k 8644鉴定所记录的电流为l型钙通道电流。前置放大器的低通滤波设置 1 khz。用 axopatch 200b型膜片钳放大器，调用pclamp软件的clampex程序，由此发出去极化脉冲波，同步采集通道开放电流，一次采集50条曲线存入硬盘。记录时，钳制电压-40 mv施予150 ms,0 mv去极化脉冲，记录ica,l。并给予-70～60 mv的系列去极化脉冲，去极化步距为10 mv，记录钙电流，以各电流幅值对相应电位作图得i-v相关曲线。
2.3 实验分组与药物处理
药物以高浓度溶解在电极液中，实验时加5～20 μl到神经细胞孵育液中，使达到所需浓度。分组：①正常对照：给予溶媒对照。②给药组: 脑心清、fldk?p70 、槲皮素、芦丁，剂量分别为5.0、10.0、20.0 μg/ml。
测定记录正常和给药条件下的海马神经细胞l?型ca2+通道活性的有关参数，记录在电脑软件上。实验在(25±1)℃温度下进行。
2.4 资料分析
全细胞记录的结果可用clampfit软件直接分析。
2.5 统计学处理
数据以(±s)表示,采用非配对t检验，p<0.05为差异有显著性。patch数用n表示。
3 结 果
3.1 海马锥体神经细胞全细胞l?型钙通道电流特性
正常海马锥体神经细胞l?型钙通道多显短暂性开放,在记录时间里,无明显的通道时间依赖性失活;当钳制电压vp为-40 mv时,可见一定的内向电流。不同钳制电压下，有不同的电流值,能被bay k 86444激活，并且被硝苯地平完全抑制。当vp=-10 mv时，l?型钙通道电流ica,l峰值,电流幅度平均值为(-192.7±46.2)pa，见图1、表1。
3.2 脑心清及其黄酮对海马神经元全细胞l?型钙通道电流幅度的影响
脑心清及其黄酮fldk?p70 、槲皮素对海马锥体神经元全细胞l?型钙通道电流幅度的影响见表1、图1-3。表1 脑心清、柿叶黄酮和槲皮素对大鼠海马锥体神经元全细胞l?型钙通道电流的影响注:*vp=-10 mv时，药物处理各组ica,l峰值(电流幅度平均值);与对照组比较:*p<0.05;**p<0.01
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清在5.0～25.0 μg/ml浓度下，均能增加海马锥体神经元全细胞l?型钙通道电流(ica,l)峰值(p<0.01)，并呈浓度依赖性增加，增加最大值分别为61.6%,55.3%,52.0%,可使ica,l的i?v相关曲线下移，在不同钳制电压下电流幅度均有增加，但没有电压依赖性特征(不改变i-v相关曲线的形状)，也不改变钙通道的电学特征(最大激活电位在10 mv附近也未改变)，见图1-3和表1。提示它们对海马锥体神经细胞l?型钙通道有激活增强作用，并且这种激活是在钙通道结构和功能没有受到破坏的情况下激活。
对海马锥体神经元全细胞l?型钙通道电流最大幅度增强作用的强度从大到小顺序为槲皮素>柿叶黄酮>脑心清。
4 讨 论
中枢神经系统神经元上存在l、n、p、q、r、t等6种类型的电压依赖型钙通道,它们各自有不同的电生理学特征[3]。本实验由于细胞外液中的ttx选择性地阻断了钠通道，外液中的tea和电极内液中的cs+选择性地阻断了钾通道，所记录到内向电流为钙电流。其开放动力学特征与文献报道高电位激活电压门控性钙通道有相似的电学特征性[3]，是典型的l型钙通道。
近年来，传统的兴奋性毒性所致的ca2+超载学说也受到挑战。虽然细胞凋亡时，大多数情况下，细胞内钙离子浓度是增高的，而且这可能是凋亡中的某些环节所必需[9]。但是，另一方面，通过多种途径提高细胞内钙离子浓度又可以减轻培养的神经元细胞的凋亡，如在培养基中加入低浓度的n?甲基d?门冬氨酸(n?methy?d?aspatrate，nmda)[10],激活电压门控的钙离子通道[1]等措施。
实验发现：在培养的交感神经元，抑制神经元凋亡的钙离子水平为180～240 nmol·l-1[17]，这比在许多细胞中引起细胞中毒的钙离子浓度水平(>5 μmol·l-1)[11]要低得多。年青的、生长因子依赖性很大的交感神经元，其细胞内钙离子浓度比对生长因子依赖性很小的年老交感神经元细胞内钙离子浓度要低。johnson em 等因此提出了一个神经细胞的存活和轴突的生长依赖于细胞内一个适宜的钙浓度的钙调定点学说[1]。认为细胞可能主要有3个不同的钙离子状态：(1)低钙离子状态，此时神经元有凋亡的危险，其存活对生长因子高度依赖;(2)中等浓度钙离子状态，适合细胞的生存，对生长因子的依赖性很小;(3)高钙离子状态，具有细胞毒性[11，13]。
据钙调定点学说，可以推测缺血后谷氨酸受体(glutamate receptor，glur2 /glur?b) 表达下调引起钙离子内流，可能具有细胞保护作用;而且，近年来的研究也表明，短暂的前脑缺血3 d后，细胞内钙离子浓度没有增高，并且电压门控钙通道电流是降低的[14]。koh jy 等报道，皮层神经元持续暴露于电压门控钙离子通道拮抗剂中，或者降低培养基中钙离子浓度都能引起细胞凋亡，这与钙调定点学说一致[15]。
nmda本身也可以减少细胞凋亡，而nmda受体拮抗剂类药物则能增加培养细胞和发育中的啮齿类神经细胞的凋亡。这些结果表明nmda受体拮抗剂类药物对缺血性脑损伤的治疗可能具有双刃剑的效果：一方面可降低由于钙超载引起的兴奋性神经元的坏死; 另一方面则可加重其他细胞内的钙离子缺失而引起细胞凋亡[16]。
李晓明等发现对缺血特别敏感的海马ca1区锥体神经细胞l?型钙通道活性在脑缺血再灌流早期呈瞬时升高(电流增大、开放概率和频率上升)，而在再灌流后期和晚期却持续性降低(电流减小、开放概率和频率下降)，即先激活后抑制，而对缺血不敏感的海马ca3区神经元则无此现象。此外，海马ca1区锥体神经细胞l?型钙通道活性可被细胞外氧化还原状态所调节。细胞外处于高氧化的状态时，l?型钙通道活性明显受抑制，细胞外处于高还原的状态时，l?型钙通道活性受激活(电流增大)，这在脑缺血后期的ca1区锥体神经元上呈得更明显。抗氧剂在脑缺血后期的ca1区锥体神经元上能更显著地增大全细胞l?型电压敏感钙通道电流。提示缺血后晚期l?型电压敏感钙通道的抑制可能是由于通道被氧化所致，且这种抑制可能与自由基参与海马ca1区锥体神经元缺血性神经元迟发性死亡的机制之一[17]。
总之，虽然钙超载和钙缺失是两个相反的状态，但缺血后的不同时间和不同区域，两种情形都可出现，兴奋毒性的钙超载可能主要出现于缺血早期和缺血中心区，而钙缺失和细胞凋亡可能主要出现在缺血后期和缺血边缘区。不同时间和不同区域，不同的损伤程度细胞内的钙离子浓度水平不一样，其细胞命运也不一样。可见细胞内钙的水平与缺血性神经元损伤的关系相当复杂[1，11]。
槲皮素、柿叶黄酮、脑心清均能增加海马锥体神经细胞l?型钙通道的电流幅度，提示它们对海马锥体神经细胞l?型钙通道有激活增强作用。作用强度柿叶黄酮大于脑心清，提示黄酮类是其增加l?型钙通道电流的主要活性成分。
脑心清所含黄酮类和酚酸类成分是其抗脑缺血神经保护的重要活性成分。黄酮类成分和酚酸类成分是天然抗氧化剂，能改善细胞的氧化还原状态和促进细胞抗氧化基因表达[7]，将有助于维护l?型电压依赖性钙通道的正常功能，这对缺血再灌注时缺血敏感神经元的存活有重要保护意义，可能是脑心清抗脑缺血损伤的药理机制之一。但脑心清及其黄酮成分对l?型电压依赖性钙通道的作用是直接激活，还是通过改变细胞外氧化还原状态而激活，还有待进一步研究。
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