（1.塔里木大学机械电气化工程学院，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300）
【摘 要】以红枣为试验对象，通过对不同品种、不同树龄和不同生长阶段（迅速生长期、果实重量积累期和营养积累转化期）红枣中苯丙氨酸代谢中苯甲酸含量变化研究，利用四阶多项式方程建立红枣生长中苯甲酸形成的预测多项式模型。结果表明：骏枣、灰枣的苯甲酸含量变化在果实营养积累期达到最高峰；红枣生长中苯甲酸含量的变化符合该多项式方程，所建立的四阶多项式方程决定系数在0.8934～0.9360之间，能更好的预测苯甲酸含量的变化。
关键词 红枣；苯甲酸；多项式模型
近几年在红枣中检出苯甲酸这一防腐剂成分，对红枣的安全食用及对新疆红枣产业及其制品安全性带来严重影响[1-2]。2014年，新疆农业大学食品科学与药品学院李焕荣老师研究[3]表明，红枣中的苯甲酸并不是人为添加的，也不是农药残留或诱导作用的结果，而是红枣生长中自身代谢产生的天然苯甲酸，这一结果为消费者放心食用红枣找到了理论依据。
当前，国内外对红枣中天然苯甲酸产生的机理[4]及含量的变化，各品种间是否存在差异等问题鲜见报道。因此，本文以骏枣和灰枣为原料，通过测定不同品种、不同年份和不同生长阶段（迅速生长期、果实重量积累期和营养积累转化期）的红枣中苯甲酸含量变化，建立红枣生长中苯甲酸形成的预测模型，以期为红枣生长过程中苯甲酸产生规律提供参考，为红枣中天然苯甲酸形成的机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
红枣样品来农一师阿拉尔周边果园。（迅速生长期、果实重量积累期和营养积累转化期）的骏枣（1至4年生），灰枣（2年和3年生），每10天采一次样进行测定。
1.2 试验试剂
乙酸铵、亚铁氰化钾、乙酸锌、氨水、乙酸钠等均为分析纯；甲醇为色谱纯。
1.3 试验仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪，岛津国际贸易有限公司；LXJ-IIB低速大容量多管离心机，上海安亭仪器厂；KQ-100VDE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1 苯甲酸含量的测定
（1）按照GB/T23495-2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法》测定[5]。
（2）苯甲酸含量测定的色谱条件
仪器：高效液相色谱仪（LC-20A，日本岛津）、二极管阵列检测器（SPD—M20A，日本岛津）；色谱柱：kromasil C18柱，150mm×4.6mm；流动相：甲醇（5%）+乙酸铵溶液（95%）；进样体积：10uL；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测波长：230nm。
（3）苯甲酸测定标准曲线及色谱图
1.4.2 苯甲酸预测的多项式模型
ai是模型的参数，a=[a0，a1，...，ak-1]，K是模型参数的个数，nli，n2i，...，nMi是相应模型的匹配的幂次，M为变量数。
1.4.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2003作图，进行数值拟合。
2 结果与分析
2.1 红枣生长中苯甲酸含量变化规律
由图3、4可知，在生长过程中，1至4年生骏枣、2至3年生灰枣中苯甲酸含量在不同生长阶段的变化呈上升的趋势，营养积累期时开始升高。
不同树龄的红枣，苯甲酸含量差异不显著（P＞0.05）；骏枣与灰枣品种间苯甲酸含量差异显著（P＜0.05）。
2.2 红枣生长中苯甲酸预测的多项式模型
由图5、6、7、8、表2可知，利用四阶多项式回归在骏枣生长中苯甲酸预测的数学模型，相关系数分别为R=0.8934、0.9361、0.9131和0.9360。说明四阶多项式回归数学模型是较佳模型，为预测骏枣生长中苯甲酸含量变化的有效数学模型。
表3 灰枣生长中苯甲酸预测的多项式方程
由图9、10、表3可知，灰枣生长中苯甲酸预测的四阶多项式回归数学模型是红枣生长中的较佳模型。相关系数分别为R=0.8813和R=0.9360。
3 结论
红枣生长中苯甲酸变化具有一定的规律，在果实营养积累期迅速增大。不同品种红枣苯甲酸含量存显著性差异。在骏枣、灰枣生长中苯甲酸含量变化建立的四阶多项式数学模型，决定系数R2均在0.8934～0.9360之间，方程拟合精度高，可以有效的对红枣生长过程中苯甲酸含量的变化进行预测。
参考文献
［1］初乐，吴茂玉，朱风涛，等.新疆地区红枣产业现状及发展建议[J].农产品加工（学刊），2012（4）：110-113.
［2］GB2760-2011 食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].
［3］孙屏，吕岳文，刘超，崔海滨，李焕荣.新疆红枣中天然苯甲酸含量的调查研究[J].新疆农业科学，2014，51（2）：235-240.
［4］唐文强，刘长海.天然苯甲酸生物合成机制的研究进展[J].中国调味品，2011，36（8）：12-15.
［5］GB/T23495-2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法[S].
［6］谢国祥，吴丽莉，宋如森，等.乳制品中马尿酸的检测及其在发酵过程中动态变化研究[J].中国调食品科学，2005，26（9）：426-429.
酸枣、6%亚硫酸、蔗糖、柠檬酸。
二、主要设备
提升机、打浆机、刮板过滤机、卧式离心过滤机、储酒罐、JJ-2型组织捣碎机、高温瞬时灭菌机、灌装机、贴标机。
三、操作要点
1．原料处理：选择八九成熟的酸枣，剔除酸枣中的腐烂果、残次果、病虫果、未成熟果以及枝叶等杂物，用流动水冲洗干净。
2．酸枣原汁的制备：
（1）浸泡。由于酸枣果肉的含水量较少，因此，在压破后的酸枣果肉中加入其1倍体积量的4%脱臭酒精软化水进行浸泡，并加入100毫克/升左右的6%亚硫酸。
（2）破碎。待枣果浸泡膨胀后，用打浆机破碎，去除枣核。
（3）提取。将枣浆放入夹层锅中，保持80℃温度，浸泡20小时左右。在浸泡过程中搅拌4~5次，使酸枣的营养成分充分溶解到汁液中。为了提高出汁率，在生产过程中加入果胶酶对果浆进行处理。
（4）过滤。提取结束后，先用0.5毫米的刮板过滤机粗滤，以除去粗纤维和其他杂质；再用筛网为120目的卧式离心过滤机精滤，以除去全部悬浮物和容易产生沉淀的胶粒；调整可溶性固形物含量至25%左右备用。
3．酸枣原酒的制备：
（1）焙烤。酸枣的烘焙在铜或不锈钢容器内进行，掺入一定量的粗砂作热媒介焙炒至酸枣外观变为棕黄色为止。
（2）浸提。经烘焙后的酸枣可直接加入酒精度50%的国家二级酒精中进行浸泡，酒精与酸枣的用量比为3∶1，浸泡10~15天，使焦糊酸枣的香气、糖分及其他营养成分浸提出来。
（3）过滤。浸提结束后，先用0.5毫米的刮板过滤机粗滤，以除去粗纤维和其他杂质；再用筛网为120目的卧式离心过滤机精滤，以除去全部悬浮物和容易产生沉淀的胶粒，得到酸枣浸泡酒。
4．酸枣露酒的制作：
（1）调配。将上述制得的酸枣原汁与酸枣浸泡酒按重量比2∶1的比例混合，搅拌均匀，对酒度和糖、酸度进行适当调整。
（2）陈酿。刚调配出来的酸枣露酒口味粗糙，香味不足，酒体不协调，必须经过一段时间的储存才能使酒质芳香醇和、酒体丰满协调。在陈酿过程中，要做好酒的管理，定期检查酒的液面、检测酒的总酸和挥发酸含量。如果酒面有菌斑，可采用除菌膜膜滤的方法除菌。如果酒的挥发酸过高，说明酒污染了醋酸杆菌，可以采用超高温121℃ 3秒钟瞬时杀菌的方法处理。
（3）澄清。储酒过程中如不能达到自然澄清，可添加适量的澄清剂加以处理。
关键词：酸枣仁；非正品；伪制品；鉴别
中图分类号：R285文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2690-02
Identification of Qualified、Unqualified and Counterfeit Spina Date Seed
HAN Junying，LI Junsong,ZHANG Tong, WU Tao
(Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)
Abstract:Objective: The goal was to provide experimental evidences for the specificity identificaition of qualified 、unqualified and counterfeit Spina Date Seed.Methods: Using Characteristic identification and microscopic-identification to identify qualified、unqualified and counterfeit Spina Date Seed.Result:By Characteristic identification we can observe that Semen Hoveniae is a little small and has hard seed coat which isn't fragile;there isn't longitudinal corddesign in the flat side of Lizaoren and counterfeit Spina Date Seed ; by decorticating we can observe that Spina Date Seed is yellowish-white and the counterfeit Spina Date Seed is peachblow ;there is obvious difference in colour among them.In microscopic-identification maps, Cotyledons epidermal cells of Spina Date Seed includes Calcium oxalate crystals and fewer oil droplets;there is no Calcium oxalate crystals in endosperm and epidermal cells of Lizaoren and counterfeit Spina Date Seed,but they includes more oil droplets; palisade cells of seed coat of Semen Hoveniae whose perispern includes cluster crystal and prisms and epidermal cells including cluster crystal is much bigger than others.Conclusion:The study provided experimental evidences for the specificity identificaition of qualified 、unqualified and counterfeit Spina Date Seed.
Key words:qualified Spina Date Seed; unqualified Spina Date Seed; counterfeit Spina Date Seed; identification
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收稿日期：2011-07-31
基金项目：上海市创新团队及重点学科资助项目（J50302）
作者简介：韩军营（1989-），女， 学士，研究方向：中药学。
通讯作者：李俊松 （1974-），女，主管中药师，研究方向：中药鉴定学研究。酸枣仁始载于《神农本草经》，列为上品，李时珍谓“其仁甘润，故熟用疗胆虚而不得眠、烦渴虚汗之症。生用疗胆好眠”\[1\]。《中华人民共和国药典》2010年版有收载\[2\]，为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子。酸枣仁具有补肝、宁心、敛汗、生津之功效。用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症\[3\]。药理研究表明：本品具有镇静催眠，镇痛抗惊厥、降血脂及抗血小板聚集、增强免疫功能等作用\[4\]。
由于主流商品酸枣仁野生资源减少，资源供不应求，市场上出现了掺伪现象。现有用非正品“理枣仁”和“枳椇子”以及伪制品\[5\]充酸枣仁的现象，四者药材性状相似，掺伪时不易发觉。理枣仁具有清热止痛，收敛止泻的功效；用于烧烫伤，咽喉痛，腹泻，痢疾。枳椇子具有清热、利尿、解酒毒的功效；用于醉酒、烦热、口渴、呕吐、二便不利。三者若冒用为酸枣仁，则威胁到临床用药的安全、有效。必须对四者加以鉴别，以免冒用或误用，而四者间的相互鉴别尚缺乏完整系统的研究。本研究对四者进行了细致的性状、显微比较，情况如下。
1 材料与仪器
酸枣仁及理枣仁（市售，经上海中医药大学中药标本室鉴定）、枳椇子、酸枣仁伪制品（上海中医药大学标本室提供）；Motic 102M双目显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）：水合氯醛、甘油酒精
2 实验方法与结果
2.1 药材性状鉴别
取上述所得酸枣仁及理枣仁、枳椇子、酸枣仁伪制品观察，结果见表1。
2.2.1 取上述药材分别置研钵中研磨成粉末，过四号筛，根据《中华人民共和国药典》（2010年版）附录ⅡC规定，对药材粉末进行水合氯醛制片法，观察三者显微特征；结果见表2，图1。
1.种皮栅状细胞横断面 2.种皮栅状细胞表面观 3.内种皮细胞表面观 4.子叶细胞含草酸钙簇晶 5.外胚乳细胞含方晶 6.种皮表皮细胞底面观 7.内种皮细胞侧面观
图1 酸枣仁、枳椇子、理枣仁、酸枣仁
伪制品的粉末特征简图2.2.2 为进一步验证酸枣仁与其非正品细胞中所含晶体的不同，定向刮取其胚乳部分，以水合氯醛制片观察；结果见图2～3。
图2 酸枣仁子叶细胞及枳椇子外胚乳细胞特征简图
图3 晶体彩色相片3 讨 论
性状鉴别中，枳椇子略小且种皮坚硬，不易破碎；理枣仁及酸枣仁伪制品平坦的一面无纵线纹；剥去外皮后，酸枣仁为黄白色，而其伪制品为桃红色；三者在颜色方面有明显差异。
显微鉴别中，酸枣仁子叶表皮细胞含草酸钙结晶，且油滴较少；理枣仁与酸枣仁伪制品的胚乳及子叶细胞均无草酸钙结晶，且油滴众多；枳椇子的种皮栅状细胞比前三者明显较大，其外胚乳细胞含簇晶、方晶，子叶细胞含簇晶。
在对酸枣仁伪制品做过性状及显微特征鉴定后，可初步判断该伪制品为理枣仁染色后得到。
本文采取显微鉴别的方法简单直观，可对样品做出真伪定性、质量优劣的判断。此法可为酸枣仁的非正品与伪制品的鉴别提供依据，但评价其质量优劣仍有待于利用含量测定等方法做进一步研究。
酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B是酸枣仁中的主要有效成分，研究\[5\]表明云南省的地方用药理枣仁中同样含有二者，其它成分氨基酸、糖等与酸枣仁相同。在性味、功能、主治方面，酸枣仁甘、酸、平，补肝、宁心、敛汗、生津，主要用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗等症。理枣仁也有此功效。基于此，建议将理枣仁列入作为酸枣仁代用品的进一步研究，以期扩大珍贵药材的药源。
参考文献
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\[4\] 吴建方．酸枣仁及其混淆品理枣仁的鉴别\[J\]．中国实用医药，2008，3（31）：134．
1、枷口期的管理及夏剪技术
冬枣坐果后，要想保证所坐的幼果不脱落，第一，需要对枷口进行严格管理；第二，需要继续进行夏前摘心。
加强枷口管理，首先要保证枷口从花期环剥之日起，到枷口能够愈合好所需要的天数（35天以上），低于35天往往会引起幼果脱落。保持枷口愈合期达到35天以上的主要方法是当枷口快要愈合时、反复扒开枷口（环剥），令其不能愈合来掌握。要密切注意害虫对枷口愈伤组织的危害，每隔6～7天用菊酯类杀虫剂，或吡虫啉等涂抹枷口，或喷枷口四周，保证环剥的枷口不被害虫咬坏。待枷口维持30天左右时，若枷口愈合速度较慢，要尽快用泥封住，促其愈合；预计难以愈合的，可以使用“枷口愈合剂”来促进愈合。使用方法：将枷口部位割开新茬，把枷口剂愈合对水10倍（有的配方对水20倍），用少许溶液涂抹，之后再用泥封住整个枷口。
对于夏剪摘心，凡是在花期没有做到及时摘心，或夏剪摘心不彻底的枣园，这个时期要继续进行枣头摘心，要将全树所有的新老枣头全部去掉，使树体营养尽可能多地集中到幼果发育中去。
2、幼果期的化学控制技术
幼果期的管理不仅要保证所坐的幼果不脱落，而且还需要幼果快速膨大，为提高后期大果率奠定基础。由于冬枣的枣吊有二次生长的特性，当坐果后不长时间、幼果发育到绿豆粒大小的时候，它所在的枣吊又要继续向前延伸、生长。这期间营养生长争夺养分的强度往往大于生殖生长，从而造成幼果生理落果。各地经验，这时使用中、后期枣丰灵（也叫枣丰灵2号），或枣丰灵5号（也叫赤霉素伴侣）效果比较理想。用法是枣丰灵2号）1克用酒精，或高度白酒化开后对水35千克左右全树喷洒；连用2次，中间间隔1周左右。这两次主要是防止促进幼果快速发育膨大，防止幼果脱落。为提高后期冬枣的大果率，用过二次以后还可以考虑再用1次（第三次），从而使幼果的个头在这一时期发育到比较大的程度，后期再膨大、发育到商品果就水到渠成了。
在这一阶段也可用枣丰灵5号来代替枣丰灵2号，其用法同枣丰灵2号。所不同的是，枣丰灵5号只需用水化开、对水就行了。
3、幼果期施肥技术
冬枣树生长势强对肥水条件要求较高。从我们近年研究的结果看，春季大量施肥，特别是大量施用氮肥，不利于开花坐果和幼果发育。冬枣施肥一般分为两次：第一次放在秋季采收后，以基肥为主，同时施用磷肥。第二次在幼果期，以化肥为主，而且需要重施；在化肥中以氮肥、钾肥为主，也需适当施部分磷肥。冬枣开花坐果要消耗大量的树体营养。坐果以后必须追肥。
具体施肥量是，结果大树每株施磷酸二铵0.5千克左右，尿素0.5千克左右，硫酸钾0.5千克左右；或10%以上的三元复合肥1.5～2.5千克；初结果树相应减半：每株追施磷酸二铵0.25千克左右，尿素0.3千克左右，硫酸钾0.3千克左右；或10%以上的三元复合肥1.5千克左右。
施肥方法可采用多穴深施法或放射状沟深施法，施肥后根据天气情况和土壤墒情确定是否进行浇水。
可结合喷药，进行叶面喷肥，自6月下旬至7月下旬，每隔15天喷一次喷施0.3％的尿素和0.2％磷酸二氢钾等溶液等。
4、病虫防治技术
在我国北方，幼果期正值雨季，是多种虫害和病害暴发的多发季节，虫害主要防治对象是桃小食心虫、红蜘蛛、金龟子、苜蓿盲椿象、黄刺蛾、龟蜡蚧等；病害方面主要防治果实炭疽病，叶片斑点落叶病、锈病，枝干干腐病及后期浆烂果病等。
雨季防治病虫害施用农药与一般季节不同，既要考虑农药的长期内吸效果，采用一些内吸性杀虫剂、杀菌剂；也要考虑到随时遇到降雨时的短期药效,选用一些触杀性杀虫剂、杀菌剂。同时还要考虑杀虫剂与杀菌剂混合使用，或交替使用等。喷药要在叶片正面、背面、枝干、果实都要着药；重点作好雨后用药，雨后及时用药，尽量选用耐雨水冲刷、持效期长的药剂；严格按照药剂使用说明进行配药，防止发生药害。
随时监测病虫发生的情况，要根据病虫发生情况及时用药，一般每隔7～10天用药1次，可选用90％万灵粉剂3000倍液加30％吡虫啉微乳剂5000倍液，或加2.5％功夫3000倍液喷雾。也可选用下列杀虫剂、杀菌剂：敌杀死、阿维啶虫脒、艾美乐、保得、瞬间、灭扫利、功夫、阿西尔、杜邦万灵、灭幼脲3号；波尔多液、三唑酮、抗枯宁、甲基托布津、大生M-45、扑海因、净菌特、农用链霉素等。具体使用方法见说明书。
近年来无公害绿色食品的生产发展很快，在冬枣的病虫害防治过程中应该提倡使用以生物制剂为主的无公害农药。
要特别注意枣锈病发生。防治方法是在这一时期提前使用波尔多液进行预防。经验表明，选用多量式波尔多液效果较好。
在枣树上使用波尔多液，一般用多量式，其配比是，硫酸铜∶生石灰∶水为1∶4∶200。
枣农自己配制波尔多液，可采用纯度高的深蓝色的块状硫酸铜（或已粉碎成粉的）和新鲜生石灰。配制时，首先将硫酸铜用热水化开，使其溶解成绿蓝色的液体；同时也将生石灰用水化成石灰乳，再按规定的比例，将水分别放入装有上述两种成分的桶内，然后采取两桶并入法，将上述两种药液同时倒入一个大桶内，一边倒，一边搅拌，使之成为天蓝色的溶液。
除采用上述方法配制外，也可采用下列方法配制将生石灰和硫酸铜分别放在两个非金属容器内，用少量热水化开并放凉，再将1/3的水放入石灰乳中，将另外2/3的水放入硫酸铜溶液内。然后将硫酸铜溶液倒入石灰乳溶液内，一边倒，一边搅拌，使液体呈天蓝色即可。波尔多液不稳定，应该随用随配，存放时间不得超过24小时。
提到“福运泉”，在京生活工作的人们马上就会想到那首由福运泉野酸枣开发公司当家人邵福运亲自策划并演唱的“野酸枣，滴溜溜圆，福运泉，纯天然”的民谣小调来，经媒介传播后，引起轰动效应，一粒小酸枣，唤起了无数成年人儿时的梦，也凝聚着创始人邵福运老人的酸枣情、酸枣梦！
■儿时对摘酸枣逮蝈蝈的酷爱，促使邵福运走上了真野生酸枣“熬出”液福运泉的创业之路
在京西门头沟山区，天然生长着满山遍野的野生酸枣灌木丛。每年的金秋季节，山里的酸枣依次成熟，“小小灯笼满山挂”的景致，特别诱人。那个年代的家庭很少有水果吃，酸枣就成了小孩子们的可口零食，又酸又甜，约上小伙伴儿去摘酸枣，这就是在京郊门头淘山区长大邵福运儿时最高兴的事情。儿时摘酸枣、逮蝈蝈、用酸枣面冲水喝的邵福运，从那时起就蒙胧中产生了将来把这种野生小果变成人人都能享受到的天然健康食品的想法。
源于儿时对野生酸枣的热爱，一次偶然的机遇，通过开办商贸公司得到了创业资金后的邵福运，获得了将自古以来除极少量酸枣仁被用做中药外，基本都自生自落、废弃荒山的野生酸枣，创制成为人们健康助力的真天然福运泉的机会。
■具有“……久服安五脏、轻身、延年、烦心、不得眠、坚筋骨、益肝气……”等食疗作用的野生酸枣和永远保持真天然的福运泉。
野酸枣（又称山枣）为鼠李科植物酸枣的干燥果实，是一种无须人工占耕地、施化肥、打农药种植的野生果实。酸枣一般为圆型，成熟时暗红色，民间常用酸枣来制作酸枣面类风味食品，以酸枣入药则更是常见。早在2000多年前，中国人就发现了野酸枣的药用功能及营养保健作用，中国医药典籍对此多有记载。《神农本草经》中有：补中、益肝气、治心腹寒热、烦心、烦渴、不得眠，坚筋骨，令人体健，轻身延年。现代科学检测证明：酸枣含有多种营养成分，其维C含量相对较高，被誉为“维C之王”。同时，也被老百姓称为“长寿果”，小小的不起眼的野生酸枣却也浑身是宝。
然而，众所周知，野酸枣除了又大又硬的枣核，只有一层薄皮，枣肉很少，又不是橘子、苹果等可以榨出汁液的水果，那么，怎样才能工业化生产出完全保留野生酸枣天然营养、味道、食疗作用的野生酸枣饮品福运泉呢？在专家的技术指导下，邵福运及其同盟者们，根据国际通用的干果浸汁、渗滤技术，结合中国传统的熬中药原理，将固定数量必须达到《GBl9298瓶（桶）装饮用水》国家标准的开水，和固定数量的野生酸枣干果（含酸枣仁），经先进技术、保密配方，现代化设备长时间、逐器浸取、渗滤出（“熬出”）的野生酸枣酸甜汁液，不得再加水，所含的可溶性固型物、总酸等营养和各项理化指标，必须达到Q/14A04925食品安全执行标准。使完全用天然野生酸枣（含酸枣仁）浸取、渗滤出（“熬出”），不加任何色素、香精、防腐剂、化学物的真野生酸枣“熬出”液一福运泉成为真天然的标志。
■通过多年的探索，才找到只有用达到《GB19298瓶（桶）装饮用水》国家标准的开水，才能漫取、渗滤出（“熬出”）真天然的福运泉
在创制真天然福运泉的多种原材料中，水质更是饮品质量的命脉。由于野生酸枣中所含酸性营养物质的特殊性，要生产出高品质、长期质量稳定的真天然福运泉，仅靠无污染、水质好的深井水是不行的，因地下水所含矿物质也是变化的，地下水也有“苦”、“甜”、“成”，“软”、“硬”等区别。
通过数年的探索，邵福运才带领他的技术人员，找到了用达到《GB19298瓶（桶）装饮用水》国家标准的开水，能够解决野生酸枣所含的特殊成份，与深井水中的物质易结合成白色沉淀物的技术难题。实现了不加化学物，也能将野生酸枣中的颜色、味道、营养、食疗作用浸取、渗滤出（“熬出”）真天然福运泉的技术飞跃！
■取之不尽用之不竭的野生酸枣，是真天然福运泉生生不已，缔造辉煌，完成“天然天下”目标的根基
每年的金秋时节，福运泉野酸枣开发公司都要用自己定做的野生酸枣专用收购袋上印有的野生酸枣收购质量标准，收购大量成熟度必须达到98%以上的自然长红成熟的野生酸枣。而且收购时，始终坚持逐包全部倒出验质，杜绝了搀大枣渺、水等作假行为。
由于野生酸枣灌木丛，是非常耐干旱、贫脊、主要靠特别发达的根系成串、成片自然繁殖，非常有利于大自然自己绿化荒山和水土保持。福运泉大量收购野生酸枣后，促使承包荒山的村民对酸枣树的保护，提高了当地村民的经济收入。
■PET聚脂瓶是当今世界安全的饮品容器！宝葫芦形是福运泉的专用瓶是放心容器的标志
葫是“福”芦是“禄”的谐音。古人把葫芦做为长寿、健康的象征，认为葫芦里装的必须是好东西。八仙中的铁拐李、老寿星仙翁等神仙总是背个宝葫芦。而邵福运就是凭着对这些神话中葫芦的向往，加上对消费者的极大忠诚，把产品做到让消费者喝着放心，没有任何虚假成分在内的货真价实的“福运泉”产品。
为了彻底甩开假冒、仿造！从根本上解决玻璃瓶易碎、瓶内易残存玻璃碴；金属罐内涂层易脱落，不便看到容器内饮品质量；纸制容器易对饮品造成染污等饮品容器方面的老大难问题，福运泉最终选定了属当今世界极有益于食品安全的高密度、高硬度、相对耐高温、透氧性差的（可查阅2005年10月17日中国食品报）PET聚脂瓶（不属PVC塑料）后，很多人认为宝葫芦是个玩艺儿，显包装档次太低！其实这正能说明福运泉不搞“金玉其外，败絮其中”的过度包装，诚实做产品的“商德”！
■毕生只创制不加化学物的真天然饮、食品的邵福运与为什么不加化学物也能保质的福运泉
虽然饮食品中添加化学合成物后，色泽漂亮了！味道美了！保存时间长了！生产成本低了……！但由于化学物有沉积在人体内脏中不易排出体外的特点，且随着苏丹红、二恶英、三氯氢胺等化学添加剂对人体慢性伤害的显现，更坚定了邵福运毕生只创制不加化学物的真天然饮、食品的人生及企业目标。
确定目标容易，而要把目标变成现实确往往需要付出更多的艰辛，甚至是毕生的努力。如何才能使创制出的福运泉，既要保持野生酸枣自有的颜色、味道、营养、食疗作用，又要不添加任何色素、香精、防腐剂、化学合成物的保证产品的真天然！如何要保证达到国家规定的产品保质期呢？转眼间用了近20年的时间，在逐步修改、完善、探索中，福运泉在利用传统熬中药的原理，在古人食品加工经验的基础上，结合西方巴氏灭菌、米拉德反应的科学原理，利用现代设备，终于工业化、规范化、标准化的创制出不加任何化学合成物的真天然福运泉野生酸枣“熬出”液。
为了保证福运泉的真天然，做到不加防腐剂及任何化学物，也能保证福运泉达到国家、国际规定的各项质量标准。福运泉主要研创出了以下保质措施：
1、每天生产福运泉之前，必须对整条密封的不锈钢生产线管道，进行近2个小时高压蒸气灭菌。
2、用自有制瓶模具、机器、自行生产宝葫芦型PET福运泉专用瓶的车间，与福运泉饮品的生产车间，只有用一个输送瓶子窗口相通的一墙之隔1
3、用机器对新生产的宝葫芦瓶进行灭菌的水，都是无菌水。
4、福运泉采取无菌灌装室无菌热灌装的生产工艺。
■一个研发创制型企业的成长，如同一个人的成长那样缓慢！一个连走都走不稳的人或企业，绝不能跑！否则准保摔倒！
从几十年前产生灵感要创制天然野生、药膳同源，不加化学物的野生酸枣饮、食品开始，就立志要创世界品牌的邵福运先生，从产品上市的第一代标签、包装物上，就印有地球经纬线，喻义使产品走出国门，最终走向世界。邵福运采取了伤其十指，不如断其一指！集中全部精力、财力！专项把真天然福运泉野生酸枣“熬出”液做精、做透、做成无与伦比的企业发展战略！
为了保证福运泉的真天然，从对生长野生酸枣的土壤化验开始，到为了防止倒入杯中饮用被污染，而每箱内提供每支装袋密封的吸管吸食入口！福运泉从每种原材料的选择、工艺配方、生产设备、技术人才等方面的微细之处，都已经将福运泉做成、做好！夯实了走出北京，进入全国、只要获得启动市场资金，就可以做强、做大的基础工程。
■请理解宝葫芦瓶福运泉包装显档次低、价格贵的缺点
论文摘要介绍了冬枣的丰产栽培管理技术，包括苗木繁育、定植建园、肥水管理、整形修剪、花果管理、病虫害防治、果实采收等方面，以期为推广冬枣栽培技术提供参考。
冬枣又名冻枣、苹果枣、雁过红，果实近圆形，平均果重15~19g。最大果重30g，果面有红晕，完全成熟后果面赭红色，果实皮薄肉脆，果肉较厚，细嫩无渣，味甜略酸，品质极上，果实含有人体需要的19种氨基酸和多种维生素，其Vc的含量是苹果的70倍。果实10月中、下旬成熟，比金丝小枣晚熟40d，故名冬枣。其树势中庸，适于矮化密植，早产早丰，是一个优质晚熟枣品种，目前在山东、河北、河南等省广泛栽培，经济效益良好。现将其栽培管理技术介绍如下。
1苗木繁育
冬枣的育苗可采用酸枣核育苗培育砧木，通过嫁接成为冬枣。具体方法是首先选用发育好的酸枣果去掉外皮。于12月初选背阴处挖坑，酸枣核用水浸泡两昼夜后与沙土混合放入坑中，其上覆盖草席保温催芽，春季发芽后分批播种。一般株行距为5cm×30cm，播后浇水覆土，待出苗后及时除草、施肥、灭虫，苗高20cm时打顶。冬枣一年四季均可嫁接，当年育苗可于翌年春季选直径0.5cm以上的苗木进行嫁接。嫁接方法采用劈接法，选择健壮、充实、芽眼饱满、无病虫害的枝条作接穗，在苗木离地10cm处进行嫁接，接穗成活后来年即可定植移栽。
2定植建园
冬枣适应性强，北到辽宁，南到广西，西到新疆均可栽植。冬枣对土壤要求不严，能栽植其他品种的土壤，均能正常生长，但以肥沃砂壤土为最好，忌严重内涝地块。冬枣在栽前平整土地，栽植时挖长、宽各60cm，深80cm的定植穴。将表土与厩肥混匀回填，每穴施厩肥5~10kg、过磷酸钙250g、复合肥500g。栽植时间在春秋两季，秋季在落叶后土壤封冻前进行，春季在解冻后树木发芽前栽植。栽植的密度根据土壤立地条件确定，合理密植。定植苗选用二至三年生地径1.5cm以上，苗高1.2~1.5m，生长健壮、侧根发达、无机械损伤、无病虫害的优质嫁接苗。栽植时先将苗木放在清水中浸泡10h，然后定植，株行距一般为2m×3m或3m×4m，南北行向，栽植825~1650株/hm2。栽植深度以原根茎与地表平齐为宜，栽后踏实，并立即浇透水，枣苗栽好后，一定要铺薄膜保湿增温。
3肥水管理
枣树虽耐瘠薄，但合理施肥浇水是增强树势，实现高产稳产的重要措施。移栽前施足基肥，移栽后根据树势强弱，施入复合肥，以氮肥为主，配合磷、钾肥。栽后第1年为成活缓苗期，关键是供水，主要是根据土壤湿度和降雨情况浇水，保证全年浇水3~5次。从第2年开始加强肥水管理。在萌芽、开花、幼果、果实增重4个时期应进行追肥，每次追尿素100~500g/株，磷酸二铵100~300g/株，逐年递增。追肥的深度为10~20cm。在开花期或果实增大期可采用叶面喷施尿素和磷酸二氢钾，1年喷肥3~4次。冬枣在生长前期需水量大，一年生苗土壤长期保持湿润，结果树在开花期、果实生长期不能缺水。缺水易导致落花落果，水分适宜利于授粉受精，提高坐果率。
4整形修剪
合理的整形修剪有利于改善树体结构，提高坐果率。冬枣常用的树形有主干疏层形、开心形、小冠疏形、自由纺锤形4种。一般采用主干疏层形或开心形，通风透光条件好，利于病虫害防治。密植园宜采用纺锤形树形或小冠疏形，利于提前结果。幼树定植后当年进行定干，定干高度50cm，于定干高度以上30~40cm处截干，留出整形带，整形带以内培养4~5个骨干主枝。第1、第2年的整形主要是通过拉枝、摘心、疏枝、环割等措施，培养10~15个均匀生长的骨干枝，且同一侧骨干枝间距不小于50cm。进入结果期后，主要通过清除徒长枝、密生枝、重叠枝、竞争枝、病虫枝和细弱枝，维持树势平衡，保持树冠通风透光结构。冬枣修剪分冬剪和夏剪，冬季修剪在落叶后，以发芽前2~3月为宜，修剪后要注意保护剪口；对生长直立枝要进行拉枝，角度控制在60°~80°；夏剪1年进行多次，从树木发芽开始，凡是不需要培养成结果枝的枣芽都要从基部抹去，对特别旺的结果树在坐果期应剪去一部分枣吊，对二次枝要适当剪短，以增强树体通风透光能力，促进坐果及幼果发育。
5花果管理
冬枣花量大，一般坐果率为1%左右，过多的花会消耗树体养分，应及时进行疏花。冬枣留果标准一般为强壮树1个果吊留1~2个果，中庸树1个果吊留1个果，弱树2个果吊留1个果。及时疏果防止养分过度消耗，保持树势强壮。五年生以上的结果树为促进幼果膨大，在初花期应进行开枷（环割），宽度一般为0.4~0.8cm，开枷后用消毒液涂抹伤口并用塑料薄膜包扎，枷口愈合期控制在35d左右，若枷口提前愈合，应进行第2次开枷。为促进坐果，防止落果，促使幼果膨大，在盛花期、幼果期、硬核期选用植物生长调节剂枣丰灵系列产品进行喷施，为冬枣丰产丰收创造条件。
6病虫害防治
危害冬枣的主要病虫害有枣叶锈病、枣疯病、炭疽病、干腐病、枣尺蠖、枣粘虫、黄刺蛾、桃小食心虫等。一但发生病虫害要及时对症下药，防止蔓延。防治方法：①冬季清园，深埋或焚烧枯枝落叶；刮除主干、主枝上的老皮，带出园外集中烧毁，刮皮后用生石灰水涂抹，起到杀灭病菌、越冬病虫及防寒的作用。②枣树萌芽前喷施3~5°B′e的石硫合剂防治各种病虫害。③防治枣叶锈病，于7月中旬至8月上旬及8月下旬至9月中旬各喷1次波尔多液，发病期喷粉锈宁1000倍液，可控制病情。④在防治枣疯病上，对轻病树，落叶前剪去疯枝，萌发前进行环割。有条件的可用四环素液注射或灌根。⑤防治枣尺蠖、枣粘虫、黄刺蛾，可在幼虫发生期用杀灭菊酯5000倍液，40％氧化乐果1500倍液混合喷洒，或喷洒25%灭幼脲Ⅲ号1000倍液灭杀，杀虫率达90%以上。⑥防治食心虫用50％辛硫磷800倍液，对土壤均匀喷洒，以杀死出土幼虫。成虫羽化高峰后7d左右用菊酯类农药加40％氧化乐果配成混合液均匀喷洒，效果很好。果实成熟前1个月禁用农药。
【关键词】酸枣；枣品种；基因流
0 前言
枣Ziziphus jujuba Mill.和酸枣Z.acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu[1]同为鼠李科枣属植物，为该属枣组中仅有的两个种。枣在我国具有至少3000年的栽培历史，其果实营养丰富，是我国重要的果树，同时还能防风固沙、保持水土，是优良的生态经济型树种[2]。酸枣原产我国，为栽培枣的原生种。枣与酸枣的种质资源极为丰富，分布广泛，已知的枣品种有800多个，以及众多的酸枣品种[2-3]。
枣和酸枣间的亲缘关系研究由来已久。对枣及其近缘种酸枣的形态学、花粉学及同工酶谱等多方面的比较研究，结合化石、出土文物和古文献考证及实地调查，认为枣和酸枣均原产我国，黄河中下游一带是枣的原产地和最早的栽培中心[4]。另外，鉴于自然界存在有酸枣向枣连续演进的过渡型如大酸枣等，支持枣起源于野生酸枣，是我国古代人民经过长期人工选种和栽培逐渐演化而来[2，5]。
微卫星（SSR）因为具有多态性高、共显性、可靠性高等优点，已越来越多的用于物种形成与演化的研究[6]，对种性复杂的枣树更是良好的分子标记。目前针对枣已开发了大量的SSR标记用于枣品种的系统发育关系重建[7-12]。此外，酸枣的遗传多样性和遗传结构已有研究[13]，但缺少酸枣与枣演化关系的研究。
为进一步阐明枣品种分化与野生种的亲缘关系，本研究以豫西部分枣品种为例，揭示野生酸枣与枣品种的遗传结构与基因流，为枣亲缘关系研究及资源利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 样品采集
在洛阳及周边地区采集酸枣、灰枣和扁核酸样本，每株分别取幼叶用硅胶干燥，共采集酸枣14个，灰枣和扁核酸各17个。
1.2 DNA提取、PCR扩增与毛细管电泳
针对枣叶片中多糖含量高等特点，采用改良的CTAB法从叶片中提取总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。使用20对SSR荧光引物[14]对样品进行PCR扩增，扩增体系与扩增条件与Fu et al.[14]中描述相同。PCR扩增产物在武汉擎科生物技术有限公司A3730xl测序仪上进行毛细管电泳，在软件Gene Marker v1.71中读取条带数据。
1.3 数据分析
1.3.1 遗传多样性
用Micro-Checker 2.2.3[15]检查数据的正确性，纠正读带错误，消除回声斑（stuttering），同时检测无效等位位点（null alleles）。用Genepop 4.0.10.[16]计算等位基因数目、期望杂合度Ho（Expected heterozygosity）、观测杂合度He（observed heterozygosities），并检测哈迪温伯格平衡（Hardy-Weinberg test）与连锁不平衡（linkage disequilibrium）（1，000次重复）。
1.3.2 遗传分组
采用软件STRUCTURE v2.3.2[17]对所有个体进行遗传分组。STRUCTURE采用贝叶斯聚类方法，可以评估不同类群间基因流的方向，并为同域分布居群的混合提供证据。运算枣群体数据时，将分组数K值设置为1-5，每个K值运行10次重复，每个重复运行1000，000代，前100，000代（10%）作为burn-in舍弃。最佳K值通过Ln值（Pritchard et al.，2000）与ΔK值[18]的变化曲线确定，拐点处对应的K值即为最佳K值。然后将最佳K值对应的10次重复运行的结果在软件CLUMPP 1.1.2[19]中计算平均值，计算采用Greedy比对方法，运行10，000次重复。随后在软件DISTRUCT 1.1[20]中将分组结果画图。
2 实验结果
2.1 遗传多样性
在酸枣群体中，20个SSR位点的均等位基因数为8.7，在扁核酸群体平均等位基因数为4.3，灰枣群体平均等位基因数为5.3。酸枣群体的观测杂合度与期望杂合度均最高，灰枣次之，扁核酸最低。酸枣、扁核酸和灰枣群体中分别有3、13和13个位点偏离哈迪-温伯格平衡（P
2.2 遗传分化
用STRUCTURE分组后，Ln值随着K值的变化在K=3时出现拐点，ΔK值随着K值的变化也在K=3时出现明显的拐点（图1），因此将枣群体分为3组；并据此将所有个体按STRUCTURE结果进行分组，结果如图2。三个群体整体上可以被分开，群体间的界限清晰，仅在一个居群中存在错位。在三组分类的基础上，一些混合的个体可以解释为渗入。野生酸枣与两个枣品种间的渗入是不对称的，均为酸枣流向枣品种，且流向扁核酸的大于灰枣。两个枣品种间的渗入也是不对称的，更多的是从灰枣向扁核酸渗入。
3 讨论
经过长期的人工选育，枣品种已形成了独特而稳定的遗传组成，本研究中野生酸枣、扁核酸和灰枣三者间存在明显的遗传聚类。基于ISSR分子标记对河南主栽枣品种进行了遗传关系分析表明灰枣与扁核酸聚为一类，亲缘关系较近[21]。从遗传分组结果看，扁核酸在遗传组成上比灰枣保留了更多的酸枣痕迹，说明与灰枣相比，扁核酸与酸枣的亲缘关系更近。如果遵循栽培枣由野生酸枣驯化而来的假说，扁核酸有可能是在灰枣之前被选育的。
本研究的结果表明，酸枣、灰枣与扁核酸间存在一定的基因流。虽然有研究表明河南枣主栽品种与灰枣的总群体间分化程度较高，群体间基因交流较少[22]，但基因流的方向未知。本研究基于SSR标记的结果表明，灰枣与扁核酸间的基因流方向是不对称，主要是由灰枣流向扁核酸，这种基因交流能提高扁核酸群体的遗传多样性，但同r也会减少不同枣群体间的遗传分化，增加不同枣种质资源的相似程度。已有研究表明不同地理环境在枣品种的群体进化中发挥了较重要的作用，但有些品种由不同区域间品种经过频繁的基因交流和重组选育而来，没有明显区域特征[12]。虽然三个群体中扁核酸的遗传多样性是最低的，由于基因流的作用，其遗传组成中外来成分的比例是最高的。
本研究所用SSR标记可以对不同枣品种进行清晰的遗传聚类，为枣的群体进化提供了可选工具。此外，本研究所用SSR标记及方法可用于不同枣品种的遗传结构分析，为研究酸枣与枣种质资源间的演化关系提供了借鉴。
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1 育苗前准备
1.1 育苗地选择
选择地势平坦，土壤含盐量0.03%1）2下的沙壤土，要求防护林带健全，具有灌溉条件。育苗前结合春耕，每亩施有机肥1500～2000千克作为基肥，并将15～20千克的磷二胺与有机肥拌匀，按行距开深60厘米、宽40厘米的沟，将拌匀的基肥施人沟内，厚度离地面15厘米，然后上覆10厘米的土壤并整平压实，布置输水滴灌带，之后铺盖地膜，待7～10天后即可播种酸枣。
1.2 滴灌系统配置
滴灌系统由过滤设备、施肥罐、主干管道、分干管道、副管及滴灌带组成。滴灌带间距60厘米，滴头间距15厘米，滴头流量2.4升/小时，水平出水压力0.12～0.18兆帕。
2 播种
2.1 酸枣种子选择及处理
采用新鲜的酸枣仁，成熟度95%以上，纯度98%以上。种皮褐红色、有光泽，无霉变，种仁饱满，大小均匀，破碎率不超过5%。播种前，用水选法清除种子中杂质及瘪粒后，用清水浸种6～8小时，捞出阴干后直接播种。
2.2 播种时间
一般在4月中下旬，当播种地5厘米地温稳定在12℃以上时开始播种，播种太迟，苗木当年生长量小，影响翌年嫁接。
2.3 播种方法及播种量
播种采用手推滚筒式点播器进行单行播种，播种深度2～3厘米，播种后用黄沙覆盖播种孔，并在膜面增加部分腰埂，防风揭膜。播种量视播种株行距确定，一般控制在0.5～1.2千克/亩为宜。
3 酸枣苗管理
3.1 滴水
播种后要及时滴水，保证种子发芽所需水分。在干旱沙地造林一般每5～7天滴水1次，尽量保持种子发芽湿度，但不宜滴水次数太多，以防降低地温或通气不良，影响种子发芽。同时每隔一段时间检查滴灌设备，以防堵塞管道。
3.2 定苗、补苗
播种7～10天后，检查出苗情况，并及时破膜放苗。当幼苗长至5厘米时，按株距25～30厘米定苗，留大苗壮苗，去弱苗，每穴留单株，缺苗处用移苗器移苗补齐。
3.3 施肥管理
6月上中旬，苗木进入迅速生长期，结合滴水追施化肥尿素2～3次，将尿素溶解后放人施肥罐，尿素用量5千克/亩・次。
3.4 苗木管理
当苗高达到30厘米时，摘除枣头顶芽，抑制生长，促进茎干加粗生长，并将苗木基部10厘米范围内的二次枝全部抹除，使基部光滑，力争使酸枣苗当年地径达到0.5厘米以上，以利第2年嫁接。9月初以后，停止水肥，促使苗木木质化；11月底以前进行冬灌，严禁冬灌后地面结冰，以利苗木安全越冬。
4 嫁接建园
4.1 接穗的选择及采集
接穗采自优良品种的健壮结果树或采穗圃，一般选择成熟度较高的直径在0.4～1厘米的l～2年生枣头一次枝或二次枝，以一年生枣头一次枝为最佳。接穗要求芽体饱满，无病虫害，一芽一穗或二芽一穗，采剪时间一般在休眠季节采集，以发芽前修剪最好。
4.2 接穗的处理
先把石蜡在容器内溶化，蜡温升到95～100℃时接穗蘸蜡，先蘸一头后，反过来再蘸另一头，使两次封蜡面相接，封蜡速度越快越好，蜡层薄而透明为最佳，如厚而发白，应加热增温，但不能超过105℃，也可在蜡容器下放一水盒，保持盒水微沸，说明蜡温正好，接穗大量封蜡，可用锅熬蜡，在笊篱上平摆一层接穗，迅速过蜡后，散放在苇箔上，让接穗问互不接触。
4.3 嫁接时间及方法
4月上旬至5月下旬树液开始流动至展叶期进行嫁接，嫁接方法采用劈接法，在高出地面1～2厘米平剪砧木，切砧时剪锋从剪面中央切下。接穗要求粗度略小于或等于砧木直径，接穗削面要求平滑，之后将削好的插穗插入砧木，使接穗稍厚一侧枝面与砧木面对齐，即砧穗形成层对齐，迅速用塑料条将接穗和砧木接口部缠紧，嫁接完成。
4.4 嫁接后管理
嫁接1周后，开始进行除萌，将砧木的萌芽除去，以集中砧木养分促进接口愈合和接芽生长，以后每隔1周除萌1次，连续除萌3～4次。当接穗芽抽梢长50厘米时，接口已完全愈合，此时应及时解除塑料条，在苗木解绑同时，要插杆固定枣头，以防风折。6月中旬，嫁接苗15厘米时叶面喷施0.3%的尿素和0.5%磷酸二氢钾混合液2～3次，7月上中旬，结合滴水追施化肥尿素2次.用量10～15千克亩・次。
[关键词]酸枣仁皂苷A；人工抗原；高碘酸钠法；单克隆抗体；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法
[Abstract]Immunogenic antigen （jujuboside ABSA） and coating antigen （jujuboside AOVA） of jujuboside A were synthesized by sodium periodate oxidation method for the first time Jujuboside A artificial antigen was confirmed by matrixassisted laser desorption ionization/timeofflight mass spectrometry （MALDITOFMS） The titer and specificity of the antibody in serum of immunized mice were detected by enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） The corrected relation curve of inhibition rate showed that the antibody against Jujuboside A obtained from immunized mice could bind to jujuboside A and the titer was up to 1∶4 000 The jujuboside A artificial antigen was synthesized， which can be used further to preparation of monoclonal antibody and the pharmacokinetics study of jujuboside A in laboratory animals
[Key words]Jujuboside A； artificial antigen； sodium periodate oxidation method； monoclonal antibody； MALDITOFMS
doi：10.4268/cjcmm20161020
酸枣仁为鼠李科Rhamnaceae植物酸枣Ziziphus jujuba Millvarspinosa的干燥成熟种子，具有补肝、宁心、敛汗、生津之功效[1]。酸枣仁皂苷A（jujuboside A）是酸枣仁的主要药效成分之一，有镇静催眠、抗惊厥、营养神经、降血脂等药理作用，近年来在治疗失眠、缺血性中风等神经系统疾病及心血管疾病方面得到越来越多的关注[25]。
为了研究酸枣仁皂苷A在生物体内的药物代谢过程、药物作用靶点以及药效发挥途径，需要建立一种能够快速、灵敏、定性、定量进行药物检测的生物学方法。而现有的检测酸枣仁皂苷A的方法主要为高效液相色谱蒸发光散射检测法（HPLCELSD）[6]和液相色谱串联质谱法（LCMS/MS）[7]等，这些方法均需经过复杂的预处理，灵敏度较低，特别在进行大样本药物代谢检测时，具有一定的局限性。基于中药活性小分子化合物单克隆抗体技术的中药免疫分析法，具有前处理简单、灵敏度高、特异性强、设备仪器需求少、适合高通量筛选等优势[8]，可以为中药有效成分在体内作用过程研究提供有力的支撑。
建立免疫分析方法的关键是制备特异性的单克隆抗体[9]。为制备酸枣仁皂苷A单克隆抗体，本研究首先合成了酸枣仁皂苷A的人工抗原。
1材料
11动物
SPF级雄性BALB/c小鼠5只，6～8周龄，维通利华实验动物中心提供，动物许可证SCXK（京）20120001，实验动物质量合格证号（No11400700043339）。
12试剂
酸枣仁皂苷A购自上海诗丹德生物技术有限公司，纯度≥95 %（HPLC）；牛血清白蛋白（BSA，批号29180102100），购自美国Roche公司；卵白蛋白（OVA，批号115K0730），购自北京欣经科生物技术有限公司；弗式完全佐剂（F5881，批号SL11432）、弗式不完全佐剂（F5506，批号SL12282），Sigma公司；酶标二抗（HRP标记羊抗鼠IgG，批号RPN4201），GeneScript公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 74）；碳酸盐缓冲液（CBS，pH 96，005 mmol・L-1）；洗涤缓冲液（PBST，pH 74）；终止液（2 mmol・L-1H2SO4）；底物缓冲液（pH 50 磷酸柠檬酸）。
13仪器
96 孔酶标板（Corning）；酶标仪（Tecan Safire2全波长多功能酶标仪）；841A 磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）； MALDITOFMS（Shimadzu AximaCFR Plus）。
2方法
21酸枣仁皂苷A人工抗原的合成方法
酸枣仁皂苷A为皂苷类化合物，分子结构中含有葡萄糖基团，采用高碘酸钠法[1011]，将酸枣仁皂苷A分别与BSA偶联制备免疫抗原，与OVA偶联制备包被抗原。具体原理见图1。
准确称取酸枣仁皂苷A 50 mg，充分溶解于20 mL CBS缓冲液中，准确称取NaIO410 mg，充分溶解于50 μL CBS缓冲液中，将以上2种溶液混合后，放入棕瓶密封，外层采用锡箔纸包裹，在避光室温条件下搅拌反应2 h，得到酸枣仁皂苷A氧化产物，称为A液。准确称取BSA/OVA10 mg充分溶于10 mLCBS缓冲液中，称为B液。将A液逐滴匀速加入B液中，密封避光，在室温下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至用CBS缓冲液预处理的透析袋中，搅拌下透析24 h，后改用双蒸水透析48 h，中间多次换液。将透析后的交联产物分装，于-20 ℃保存待测。
22酸枣仁皂苷A人工抗原的MALDITOFMS鉴定
仪器工作条件：质谱仪在线性模式下进行分析，正离子模式，激光能量125，检测范围m/z 2万～9万 Da。
操作步骤：精确吸取乙腈333 μL到015 %三氟醋酸666 μL中，加入10 mg芥子酸，混合液超声15 min后溶解，制得基质辅助溶液备用[12]。取酸枣仁皂苷A人工抗原适量溶解在80 mol・L-1的尿素溶液中，然后将溶液稀释至浓度为1～10 pmol・L-1；另制备50 g・L-1的BSA水溶液。各取酸枣仁皂苷A人工抗原、BSA和基质辅助溶液10 μL，充分混匀，吸取混合溶液10 μL滴加在镀金样品板上，室温下风干后，送入质谱仪分析。
23动物免疫
选取6～8周龄雄性BALB/c小鼠5只，以酸枣仁皂苷ABSA为免疫抗原进行背部皮下多点注射免疫，免疫剂量为100 μg/只。初次免疫时，采用注射器推拉法将等量弗氏完全佐剂与免疫抗原充分乳化混匀后注射，以后每2周改用等量弗氏不完全佐剂乳化免疫抗原，进行加强免疫1次，方法与剂量不变。从第4次加强免疫起，每次免疫后1周断尾取末端血适量， 3 500 r・min-1离心10 min分离血清。
24间接ELISA方法检测血清中的酸枣仁皂苷A抗体效价
以酸枣仁皂苷AOVA为包被抗原，用CBS稀释至1∶4 000，100 μL/孔加入至96孔板中，37 ℃孵育1 h。以PBST洗板，每次5 min，洗后拍干，共3次。以10 g・L-1明胶为封闭液，200 μL/孔，37 ℃孵育1 h，洗板。血清抗体的初始稀释倍数为1 000倍，以2倍为稀释梯度逐级稀释为3个质量浓度，以未进行免疫的空白小鼠血清作为阴性对照。37 ℃孵育1 h后如前法洗板，再加入HRP羊抗鼠二抗（1∶10 000）100 μL/孔，37 ℃反应05 h，洗板。加入TMB工作液100 μL/孔，37 ℃孵育显色15 min后，加入2 mmol・L-1硫酸50 μL/孔终止反应，测定450 nm处吸光度（A450）。以免疫血清（P）与阴性血清（N）A450比值大于21时定义为阳性，血清抗体的效价以血清抗体为阳性的最大稀释倍数的倒数表示。
25间接竞争ELISA法检测血清中抗酸枣仁皂苷A抗体特异性
以酸枣仁皂苷AOVA作为包被抗原，用CBS缓冲液稀释至1∶4 000，以10 g・L-1明胶为封闭液，用PBS缓冲液稀释血清至1∶4 000，酸枣仁皂苷A水溶液的初始物质浓度为1万 μg・L-1，以10倍为稀释梯度逐级稀释至001 μg・L-1，按常规间接竞争ELISA方法操作，测定吸光度A450。计算酸枣仁皂苷A对血清抗体的半数抑制质量浓度（IC50）、间接接竞争抑制曲线的线性方程和R2。根据酶标仪读取A450计算抑制率，其中空白对照组的A450为A0，加入不同浓度酸枣仁皂苷A的A450为A。
3结果
31MALDITOFMS鉴定酸枣仁皂苷A人工抗原
由MALDITOFMS检测图谱见图2，3，可知酸枣仁皂苷A人工抗原的相对分子质量为71 4016，BSA的相对分子质量为66 4473，表明酸枣仁皂苷A人工抗原偶联成功，根据偶联比的计算公式（酸枣仁皂苷A人工抗原相对分子质量-BSA相对分子质量）/酸枣仁皂苷A相对分子质量，即（71 4016-66 4473）/1 20735=410，偶联比数值经四舍五入为4个，见图2，3。
32动物免疫结果
321抗体效价检测间接ELISA法检测结果见表1。经过多次免疫，酸枣仁皂苷A对小鼠的血清抗体均产生竞争抑制作用，以P/N≥21判定为阳性，可见第1，2，4号小鼠的血清酸枣仁皂苷A抗体效价达到1∶4 000，表明已产生良好的免疫效果。为进一步制备酸枣仁皂苷A的单克隆抗体，本实验选取灵敏度更高的4号小鼠的血清进行特异性检测。
322抗体特异性检测间接竞争ELISA法检测4号小鼠血清抗体特异性。以酸枣仁皂苷A标准品浓度的对数值为X，检测结果A值为Y，绘制竞争抑制曲线，得到方程式Y=-0041 7X+0760 3，R2 =0992 3。小鼠血清抗体IC50为0001 mg・L-1，表明本实验成功制备了具有免疫原性的酸枣仁皂苷A人工抗原。
4讨论
酸枣仁皂苷A是小分子皂苷类化合物，仅具有反应原性而不具有免疫原性，需要与大分子化合物进行偶联，形成结合物后才能成为完全抗原。由于酸枣仁皂苷A分子结构中含有葡萄糖基团，本实验选用高碘酸钠法进行人工抗原的合成。该法条件要求简单，操作方便，是合成含糖基的中药活性成分人工抗原的常用方法[13]。
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