一、“细胞分化”概念内涵及层级
1.在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异。细胞的这种特化不仅是正常发育所必需的,而且还能提高细胞各种生理功能的效率。
2.一般说来,体内各种细胞均含有物种的全部基因,但基因的表达具有时空性。细胞之所以在形态、结构和功能上发生稳定性差异,是因为组织特异性基因选择表达成了组织特异性蛋白的缘故。从理论上讲,已分化的细胞仍然具有发育成一个完整个体的潜能。
3.细胞分化是渐进性的,其方向的限定早于形态差异的出现,且分化细胞的表型保持相对稳定,一般不可逆转。
之所以采用完整的陈述句的形式来表述概念,是因为这种表述方式更易于确认需要学生理解和掌握概念的内容及意义,也更易于建立概念之间的联系。
二、“细胞分化”概念教学的组织
在分析“细胞分化”的概念内涵及层级之后,教学设计应该紧紧围绕着相应的概念条款展开,通过列举事实、分析讨论,或者基于资料的探究等活动,帮助学生深层理解这些概念内涵,并基于概念理解而构建合理的知识结构(见图1)。
1.列举事实,尝试定义。呈现人的受精卵发育至胎儿的图片:列举学生熟知的根尖分生区细胞分化成伸长区、成熟区的事实,然后,引导学生抽象概括出:“细胞分化是指在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上会发生稳定性差异的过程。”这是广大教师一贯坚持的做法,值得肯定。因为事实是用来帮助学生建立和理解概念的,事实当然要围绕着概念的结构来排布。但是,定义常常不等同于概念。“定义”通常用“是……”来表述,说得十分肯定。“概念”描述一类事物的本质,有时并不用“是”来描述。在引导学生下定义之后,教师还应该设置下列问题,吸引学生深入思考细胞分化的结果和生物学意义。①在人的个体发育过程中,假若没有细胞分化,受精卵能发育成胎儿吗?为什么?②细胞在形态、结构上出现特化,对于细胞完成其生理功能有何意义?③从遗传的角度分析,受精卵为什么能够发育成一个完整个体?问题3的设置实际上是指向“细胞全能性”这一核心概念的丰富内涵,之所以在此设置问题3,一方面是因为不仅已分化的细胞具有发育成完整个体的潜能,未分化的受精卵在自然条件下更容易发育成一个完整的个体。也就是说,“细胞全能性”这一概念是随着教学进程不断建构起来的;另一方面,其用意还在于探讨细胞分化的原因,起到承上启下的教学功效。
2.探究发现,明晰原因。美国地平线研究组(Horizon Research Team)主席维斯(Weiss)及高级研究助理帕斯利(Pasley)经过了18个月的观察,对364节课详细分析,发现优质课堂主要有几个特征,其中包括:①在课堂教学过程中,教师善用多种策略,为某个科学概念提供清晰的阐释;②吸引学生从事动脑筋的活动;③帮助学生理解学科的核心概念等。因此,可以引入相关科学史对细胞分化原因进行探讨。
资料1:最早试图对细胞分化机制作出解释的学者是Weismann(1883),他根据当时对马蛔虫的研究结果,提出了“体细胞分化是由于遗传物质丢失造成的,每一种组织只保留了其特有的遗传物质”的见解。在马蛔虫这一特例中,在卵裂过程中体细胞的染色体确实发生丢失现象。因此,Weismann这一观点在当时看来既符合逻辑,又有实际例证,因而被学术界所普遍接受。你同意上述观点吗?根据是什么?
资料2:1958年Steward等利用胡萝卜根的韧皮部组织培养出了完整的新植株;1970年Steward用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株。
资料3:1969年Nitch将烟草的单个单倍体孢子培养成了完整的单倍体植株。
分析资料2和资料3,你得出的结论是什么?基于对上述3则资料的分析探究,学生就容易得出以下结论:①高度分化的植物体细胞,遗传物质并没有丢失,仍含有发育成一个完整个体所需的全套基因,具有发育的全能性;②在二倍体染色体组中,只要有一套单倍体的基因组,就含有该物种的全部遗传信息,因此,植物的生殖细胞也具有发育的全能性。至此,细胞全能性的概念内涵已昭然若揭,师生共同归纳(见图2)。学生仍然会有2个疑问:①既然已分化细胞中含有相同的遗传信息,为什么细胞的形态、结构和生理功能会出现稳定性差异?②已分化的动物细胞是否也像植物细胞那样具有发育的全能性?针对疑问1,教师可以列举事实,循循善诱,问题指向要明确,最终让学生领悟“细胞分化是组织特异性基因表达的结果”。例如:通过分子杂交实验表明,在任何时间一种细胞的基因组只有一少部分基因在活动。在幼红细胞中,糖酵解酶系的编码基因、核糖体蛋白基因是否均能表达?血红蛋白基因、胰岛素基因是否都能表达?细胞的形态、结构与生理功能主要由哪种化学物质直接体现?幼红细胞最终分化成红细胞的主要原因是什么?针对疑问2,教师要向学生说明:到目前为止,人们还没有成功地将单个已分化的动物体细胞培养成新个体,这是因为动物细胞的发育潜能随着分化程度的提高而逐渐变窄。但这种分化潜能的变化是对细胞整体而言的,对细胞核来说是否还保持着全能性呢?进而引导学生分析细胞核移植实验。
3.因果分析,把握特征。学生一旦理解了细胞分化的因果关系,就容易从中把握细胞分化的特征:①渐变性——细胞在发生形态差异之前的一定时间,细胞分化命运即已确定,基因活动模式已发生改变,从基因到蛋白质再到细胞形态、结构、功能特化是一个渐变过程。②不可逆性——分化细胞的表型保持相对稳定,以执行特
定的功能。然而,在某些条件下,分化细胞的基因活动模式可发生可逆的变化,又回到未分化状态。
[关键词] 骨髓基质干细胞；施万细胞；周围神经损伤；细胞移植；聚乳酸-聚羟基乙酸导管
[中图分类号] R338 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0090-04
周围神经损伤是显微外科常见疾病之一，常由交通意外、工矿事故等外伤引起[1]，损伤部位往往呈碾压伤、挫裂伤，造成神经较长距离缺损，单纯手术难以缝合[2]。自体神经移植一度成为治疗的金标准[3]，然而存在损伤供体部位功能的缺点，随着组织工程学的研究进展，导管支架材料联合细胞移植已经成为替代神经移植的重要方法[4]。本研究突破传统的单一细胞移植的方法，采用骨髓基质干细胞（BMSCs）与施万细胞（Schwann cells，SCs）联合移植，探讨两种细胞相互作用对神经轴突再生的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
雌性SD大鼠[中国农科院哈尔滨兽医研究所提供，许可证号：SYXK（黑）2006-032] 48只，体重（200±5）g；DMEM/F12细胞培养基（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（FBS，Hyclone公司，美国）；青-链双抗（碧云天，中国）；胰蛋白酶（碧云天，中国）；Ⅳ型胶原酶（碧云天，中国）；阿糖胞苷（Ara-C，辉瑞公司，美国）；兔抗鼠单克隆抗体S-100（武汉博士德公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；兔抗鼠表皮细胞生长因子（EGF）单克隆抗体（武汉博士德公司）；聚乳酸-聚羟基乙酸神经导管（PLGA，山东代罡生物材料公司）；多导电生理记录仪（ASB240U，成都遨生）。
1.2 实验方法
1.2.1 骨髓基质干细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，浸泡于75%酒精中10 min，无菌条件下取出双侧股骨，剪去两端，将骨髓冲到10 mL离心管中。反复吹打至单细胞悬液，1500 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬。采用全贴壁培养法，将细胞接种于培养瓶中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。培养5 d后，对细胞进行换液，弃去瓶中培养液，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养。待细胞铺满瓶底80%后传代。
1.2.2 施万细胞的分离培养 取SD大鼠10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后，无菌条件下取出双侧坐骨神经，在解剖显微镜下剥离神经外膜，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后剪成0.5 mm小段，加入0.25%胰蛋白酶和0.03%Ⅳ型胶原酶，37℃消化30 min。吸取上清加入培养液终止消化。重复消化1次，将所得单细胞悬液移入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中。1500 r/min，离心5 min，弃上清，向离心管中加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液5 mL，重悬，移入培养瓶，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。
1.2.3 施万细胞的纯化与检测 SCs的纯化采用差速贴壁离心与Ara-C抑制相结合方法[5]，每15分钟变换1次培养瓶方向，45 min后取未贴壁细胞移入新瓶。24 h后加入Ara-C培养2 d，胰酶消化后移入新瓶，待细胞铺满瓶底80%后传代。取第2代细胞进行爬片，4%多聚甲醛固定后，加入兔抗鼠S-100单克隆抗体（1∶200），4℃过夜，加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗（1∶400），孵育30 min后荧光检测。在100倍显微镜下随机选取10个不同视野，计数阳性细胞与总细胞数，计算SCs细胞纯度，公式为：SCs细胞纯度=S-100阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.2.4 实验动物的分组与模型制备 48只雌性SD大鼠随机分为A、B、C、D 4组，每组各12只：A组为BMSCs与SCs联合移植组；B组为单纯BMSCs移植组；C组为单纯SCs移植组；D组仅加入PBS作为阴性对照组。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉后俯卧位固定于操作台，右下肢常规备皮、消毒，取后外侧肌间隙游离暴露坐骨神经，在坐骨神经中段做一长10 mm神经缺损，PLGA导管连接两侧断端，均插入1 mm，各缝合2针。A组向导管内注入1×105/L浓度的BMSCs和SCs各50 μL；B组注入1×105/L的BMSCs 100 μL；C组注入1×105/L的BMSCs 100 μL；D组注入PBS 100 μL。注射完毕后逐层缝合。
1.3 指标的观察与评定
1.3.1 大体观察 观察术后切口情况，右下肢活动能力、步态变化。于4、8周处死动物后观察损伤神经的修复长度及直径。
1.3.2 坐骨神经功能指数（SFI）的测定 每组术后4、8周分别取6只大鼠，记录双下肢足印2～3对，测量损伤侧足印长度（足跟到足尖距离）（EPL）、正常侧足印长度（NPL）、损伤侧足趾宽度（第1趾到第5趾距离）（ETS）、正常侧足趾宽度（NTS）、损伤侧中间足趾距离（第2趾到第4趾距离）（EITS）、正常侧中间足趾距离（NITS）。根据公式SFI=-38.3（EPL-NPL）/NPL+109.5（ETS-NTS）/NTS+13.3（EITS-NITS）/NITS-8.8，计算SFI值，0～-12代表正常功能，-13～-99代表功能部分恢复，-100代表无功能。
1.3.3 神经传导速度（NCV）的测定 4、8周时，每组取SFI测定完毕的大鼠，麻醉后俯卧位固定于操作台上，暴露双侧坐骨神经，游离PLGA导管两侧神经干，应用多导电生理记录仪测定双侧坐骨神经的传导速度，并进行统计学分析。
1.3.4 碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的免疫组化检测 NCV测定结束后，对各组大鼠处死，取出双侧坐骨神经，去除导管，石蜡包埋后切片脱蜡，3% H2O2浸泡20 min；加入兔抗大鼠bFGF单克隆抗体和兔抗大鼠EGF单克隆抗体（抗体稀释度1∶200），室温过夜；PBS冲洗后，加入生物素二抗（抗体稀释度1∶400），37℃孵育60 min；PBS冲洗后加入新配制DAB显色。各例随机选取6张切片，每张切片随机选取5个高倍视野，应用Image-ProPlus专业图像分析系统测定平均光密度值（AOD），并进行统计学分析。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 18.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓基质干细胞的分离培养
采用全贴壁培养法换液2次后，可去除悬浮的血液细胞，贴壁生长细胞以梭形为主兼有圆形、椭圆形。8 d左右原代细胞聚集呈集落样生长，连续传5代后细胞生长良好，未发生异型性改变。
2.2 施万细胞的培养与检测
坐骨神经提取的细胞经差速贴壁法换瓶后，瓶内可见折光性较好的圆形SCs细胞与胞体较大的成纤维细胞。加入Ara-C后，成纤维细胞基本消失，2 d后SCs开始贴壁生长，发出突起，胞体拉长，呈鱼群样排列。传代后细胞形态未发生改变，经S-100抗体荧光染色后，SCs的纯度为（96.2±2.5）%。
2.3 大体观察
术后各组动物全部存活，B组1只，C组2只大鼠切口出现红肿，其余未见异常。术后全部动物出现右下肢跛行，肌力较正常侧减弱。4周时各组处死6只动物，A组可见坐骨神经已恢复连接，修复部位直径略小于正常；B、C组坐骨神经恢复连接，但修复部位直径明显小于正常；D组仅凭借神经外膜相连。8周时各组处死6只动物，A组可见坐骨神经直径与正常相似且略粗；B、C组的修复效果相似，直径略小于正常；D组修复直径较4周时略增大。
2.4 各组坐骨神经功能指数绝对值比较
术后4周A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组之间差异无统计学意义（P > 0.05）；D组作为阴性对照，其坐骨神经功能仍有部分恢复。术后8周时A组SFI绝对值优于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；A、B、C组SFI绝对值均小于同组4周时，差异有统计学意义（P < 0.05）；D组SFI绝对值在2个时间点差异无统计学意义（P > 0.05）。说明细胞移植在损伤4周后仍有修复，而单纯导管修复功能无恢复。见表1、图1。
2.5 神经传导速度测定
各组伤侧NCV均小于正常侧，差异有统计学意义（P < 0.05）；8周时A组损伤侧NCV优于4周时水平，差异有统计学意义（P < 0.05），B、C、D组差异无统计学意义（P > 0.05），说明细胞联合移植对恢复神经传导速度的作用更为持久。4周时A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组损伤侧NCV比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。8周A组损伤侧NCV大于B、C、D组，差异有统计学意义（P < 0.05）；B、C组损伤侧NCV比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；B、C组损伤侧NCV均大于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
2.6 免疫组化检测结果
在4、8周时分别对各组标本进行免疫组化检测，测定bFGF和EGF的表达水平。4周时bFGF测量AOD值，A组高于B组，B组高于C组，C组高于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；8周时bFGF测量AOD值A、B、C组差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。4周时EGF测量AOD值，A组高于B组，B组高于C组、C组高于D组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；8周时EGF测量AOD值，A、B、C组差异无统计学意义（P > 0.05），但均高于D组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。
3 讨论
周围神经损伤发生后如何提高修复神经的功能一直是显微外科面临的难点之一，常见的修复方式包括单纯缝合、自体神经移植、神经导管支架以及干细胞修复等等，单一的方法很难达到满意的效果，给患者的生活带来了极大的困扰[6]。BMSCs作为种子细胞在周围神经修复中都起到了关键作用，而SCs则能够提供丰富的营养因子，促进轴突的再生[7]。目前，体外实验表明，BMSCs与SCs共同培养表现出良好的相容性，并且能互相促进增值、分化[8]，但对二者在体内相互作用的报道较少，因此本研究利用PLGA多孔导管作为支架材料，观察BMSCs与SCs联合植入体内对损伤神经的修复效果。
BMSCs在特定的条件下具有分化为神经干细胞，进而分化为神经细胞的能力。神经干细胞能够分泌多种神经营养因子，减轻损伤所致的炎症反应，维持轴突的稳定性，防止轴索反应的扩大。损伤发生后，损伤远端SCs细胞会发生变性，产生大量的EGF和bFGF等因子，为干细胞的分化提供适宜的微环境[9]，BMSCs植入体内后，会在这种微环境下分化，使营养因子的水平呈现放大反应，加速轴突再生。同时，BMSCs分化的神经元会发出突起，交织成网，介导神经信号的传导。SCs植入体内后，会产生黏层素、Ⅳ型胶原等构成基底膜的主要成分，沿支架内壁形成神经外膜，为轴突再生提供生物支架，弥补体内原有SCs分泌的不足[10]。同时移植的SCs也能够分泌营养因子，加速BMSCs的分化作用[11]。
SFI的结果可以看出，联合移植对大鼠坐骨神经功能的恢复作用更为突出，而单细胞移植则没有差别，说明了BMSCs与SCs的移植修复作用相当，都是为轴突的再生提供了营养的支持[12]。值得注意的是，单纯导管修复大鼠仍有部分功能恢复，说明单纯应用PLGA支架材料对长距离周围神经缺损具有一定的修复作用，其可能机制为PLGA支架限制了自身SCs分泌的营养因子外流，在导管中浓聚，促进了轴突的重连。NCV测定结果与SFI基本一致，但在4周后，联合移植大鼠的NCV仍有提高，而单纯移植则不显著，说明了细胞联合移植的修复作用更为持久，这可能与BMSCs分化产生的神经元传导电活动有关，而单纯BMSCs移植由于缺乏营养因子的支持，分化的神经元比例较少。对所用损伤侧NCV可以看出，无论是那种移植方式，其NCV都不及正常侧的1/2，这也是周围损伤修复效果不理想的体现。对于无BMSCs大鼠，没有分化来源的神经元介导信号传递，仅凭借SCs产生的营养因子不能够满足损伤近端轴突的长距离生长；对于含有BMSCs大鼠，其分化产生的胶质细胞可能会阻碍神经信号的传递，两种原因都可能导致NCV的减慢。
EGF和bFGF是促进轴突生长的重要神经营养因子[13]，研究表明，二者联合作用的效果要明显强于单独应用，且二者联合应用具有诱导BMSCs向神经元分化的作用[14]。本实验检测EGF和bFGF的表达，可见短期内（4周）联合移植组营养因子的表达水平更高，BMSCs所分泌的营养因子水平高于SCs，而在长期（8周）则无明显差别，可能是与随着时间的进展，细胞分化且营养不足有关。但由于条件限制，检测尚存在不足，如果对体内的全部营养因子进行蛋白组学的鉴定，则可全面分析细胞移植对神经再生的影响。
综上所述，BMSCs与SCs联合移植能够促进损伤轴突的再生，恢复神经功能，对周围神经损伤具有明显的修复作用。
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作者认为这一定义的概括性较强，内涵也更有深度。虽然对细胞的概念可以做各种各样的理解和解释，但作者认为应从以下一些角度去认识细胞作为生命活动基本单位这一概念。
(1)一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位。
一切有机体均由细胞构成，只有病毒是非细胞形态的生命体。
(2)细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位。在有机体一切代谢活动与执行功能的过程中，细胞呈现为一个独立的、有序的、自动控制性很强的代谢体系。
(3)细胞是有机体生长与发育的基础。一切有机体的生长与发育是以细胞的繁殖与分化为基础的，这是研究生物发育的基点。
(4)细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性。每一个细胞，不论低等生物或高等生物的细胞，单细胞生物或多细胞生物的细胞，结构简单或复杂的细胞，未分化或分化的细胞（除个别终末分化的细胞外），性细胞或体细胞都包含着全套的遗传信息，即全套的基因，也就是它们具有遗传的全能性。
【关键词】白细胞分类计数；临床意义；检验科
白细胞分类计数是临床血液学检验中的常规检验项目[1]。随着基础医学及计算机科学的飞速发展，使得血液学检验技术突飞猛进，特别是近几年来各种新型的血细胞分析仪以其自动化程度高、检测参数多等优势而不断充斥市场，这对减轻检验人员劳动强度和提高检测速度无疑起着积极的作用。现将我院检验科进年来总结的白细胞分类计数的临床资料报道如下。
1材料与方法
1．1 材料:仪器日本Sysmex XT-1800i全自动五分类血细胞分析仪；日本产尼康显微镜。试剂：原装进口配套试剂。标本来源：我院近3年经过血常规检查的1988例我院住院患者。
1．2方法:仪器法采取患者静脉标本2 ml注入EDTA—K：真空抗凝管中，在25℃室温下3 h内检测完毕。手工镜检法：将经过仪器检测完毕的患者抗凝标本制作成薄厚适宜的血片，依据全国临床检验操作规程，用瑞氏一姬姆萨染液染色后，选择经验丰富、技术熟练的检验人员在油镜下计数分类200个白细胞，并求出各系所占比例的平均值。
2结果
白细胞分类计数具有较高的临床价值，白细胞检验结果在一定程度上决定着临床诊疗的正确诊断和治疗。值得临床医师参考使用。
3讨论
人体血液中非细胞成分包括血清或血浆，细胞成分包括红细胞、白细胞和血小板。在末梢血液中，根据白细胞胞浆中有无颗粒，分为粒性白细胞和非粒性白细胞。粒性白细胞中包括中性粒细胞(又分杆状核及分叶核)、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；非粒性白细胞中包括淋巴细胞及单核细胞。其中中性粒细胞和单核细胞在人体内游戈，可以吞噬和消化进入人体内的细胞等微生物，还能吞噬人体坏死的细胞。淋巴细胞分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、K细胞，它们参与人体的细胞免疫和体液免疫反应。白细胞总数的增多或减少， 以及分类的改变，均有一定的临床意义。
3.1嗜中性粒细胞(N) :在外周血中可分为中性杆状核粒细胞(NST)和中性分叶核粒细胞(NSG)两类。
3.1.1嗜中性粒细胞增多：嗜中性粒细胞增多常伴随白细胞总数的增多[2]。在生理情况下，下午较早晨为高，妊娠后期及分娩时，剧烈运动或劳动后，饱餐或淋浴后，高温或严寒等均可暂时性增高。病理性增多见于：急性感染。严重组织损伤及大量血细胞破坏。如严重外伤，较大手术后，大面积烧伤，急性心肌梗死(心绞痛时不增高)及严重的血管内溶血。急性大出血。急性中毒。白血病及恶性肿瘤。
3.1.2嗜中性粒细胞减少：
X线、γ射线，放射性核素；苯、铅、汞以及氯霉素、磺胺类药、抗肿瘤药、抗糖尿病及抗甲状腺药。单核一巨噬细胞系统功能亢进。自身免疫性疾病。如系统性红斑狼疮等。
3.2嗜酸性粒细胞(E)
3.2.1嗜酸性粒细胞增多：①过敏性疾病。支气管哮喘、药物过敏反应、荨麻疹、食物过敏、血管神经性水肿、血清病等。②寄生虫病。血吸虫病、肺吸生病、蛔虫病、钩虫病等。③皮肤病。如湿疹、剥脱性皮炎、天疱疮、银屑病等。④血液病。如慢性粒细胞白血病，嗜酸粒细胞白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、嗜酸性粒细胞肉芽肿等。⑤某些恶性肿瘤。如肺癌等。肿瘤治疗有效往往伴随着嗜酸性粒细胞增多的改善。⑥某些传染病。如猩红热时反而增多。
3.2.2嗜酸性粒细胞减少：见于伤寒、副伤寒初期、大手术、烧伤等应激状态或长期应用肾上腺皮质激素后，其临床意义甚小。
3.3嗜碱性粒细胞(B)
3.3.1嗜碱性粒细胞增多：①过敏性疾病。结肠炎、药物、食物、吸人物超敏反应、红斑及类风湿性关节炎等。②血液病。如慢性粒细胞白血病，嗜碱性粒细胞白血病，以及骨髓增殖性疾病的骨髓纤维化等。③恶性肿瘤。特别是转移癌时。④其他。如糖尿病、水痘、流感、天花、结核等。
3.3.2嗜碱性粒细胞减少：无临床意义。
3.4淋巴细胞:
3.4.1淋巴细胞增多：①感染性疾病。病毒感染如风疹、麻疹、流行性腮腺炎，传染性单核细胞增多症、传染性淋巴细胞增多症、病毒性肝炎及肾病综合征出血热等。此外，某些杆菌，如百日咳鲍特杆菌、结核分枝杆菌、布氏杆菌及梅毒螺旋体、弓形体等。③淋巴细胞性恶性疾病。急性和慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤白血病、毛细胞白血病等。③其他。自身免疫性疾病、肿瘤，慢性炎症、GVHR或GVHD等[4]。
3.4.2淋巴细胞减少：主要见于接触放射线及应用肾上腺皮质激素、烷化剂、抗淋巴细胞球蛋白和先天性免疫缺陷性疾病和获得性免疫缺陷综合征。
3.5单核细胞:
3.5.1单核细胞增多：生理性增多见于婴幼儿及儿童。病理性增多见于：①某些感染。如感染性心内膜炎、疟疾、黑热病、急性感染恢复期、活动性肺结核等。②某些血液病。如单核细胞白血病，粒细胞缺乏恢复期、多发性骨髓瘤、恶性组织细胞病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征等。
3.5.2单核细胞减少：无临床意义。
定期观察疾病过程中白细胞的变化，可以了解疾病的演变。通常在感染的急性期，主要表现白细胞总数增加，中性粒细胞增高[5]。如中性粒细胞仅为轻度增加，未成熟者极少，常表示轻度感染；如白细胞增加明显或反而减少，且未成熟者明显，常表示严重感染。但老年人患感染性疾病后白细胞并不明显增加。
参考文献
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[2]张之南，杨天楹，郝玉书．血液病学．第l版．人民卫生出版社．2003：1109
[3]吴茅，王海英，陈秉宇，等．血细胞分析仪提示中性粒细胞增高标本指标被忽视及其对策[J]．临床检验杂志，2002，20：47-48
导语：生物是其他学科的学习基础，掌握生物知识点对同学们生物学习非常重要，以下是
第一单元 生物和生物圈生物的特征:1、生物的生活需要营养 2、生物能进行呼吸 3、生物能排出体内产生的废物4、生物能对外界刺激做出反应 5、生物能生长和繁殖 6、由细胞构成(病毒除外)调查的一般方法步骤：明确调查目的、确定调查对象、制定合理的调查方案、调查记录、对调查结果进行整理分析、撰写调查报告生物的分类(按照形态结构分：动物、植物、其他生物;按照生活环境分：陆生生物、水生生物;按照用途分：作物、家禽、家畜、宠物)生物圈是所有生物的家生物圈的范围:(大气圈的底部：可飞翔的鸟类、昆虫、细菌等;水圈的大部：距海平面150米内的水层;岩石圈的表面：是一切陆生生物的“立足点”)生物圈为生物的生存提供了基本条件：营养物质、阳光、空气和水，适宜的温度和一定的生存空间环境对生物的影响非生物因素对生物的影响：光、水分、温度等光对鼠妇生活影响的实验P15探究的过程：1、提出问题 2、作出假设 3、制定计划 4、实施计划 5、得出结论 6、表达和交流对照实验 (P15)生物因素对生物的影响：最常见的生物间关系是捕食关系，还有竞争关系、合作关系、寄生关系生物对环境的适应和影响现在生存的每一种生物，都是有与其生活环境相适应的形态结构和生活方式。生物对环境的适应P19的例子生物对环境的影响：植物的蒸腾作用调节空气湿度、植物的枯叶枯枝腐烂后可调节土壤肥力、动物粪便改良土壤、蚯蚓松土增加土壤的通气性生态系统的概念：在一定地域内，生物与环境所形成的统一整体叫生态系统。一片森林，一块农田，一片草原，一个湖泊，等都可以看作一个生态系统。生态系统的组成生物部分：生产者、消费者、分解者非生物部分：阳光、水、空气、温度植物是生态系统中的生产者，动物是生态系统中的消费者，细菌和真菌是生态系统中的分解者。食物链和食物网：食物链以生产者为起点，终点为消费者，且是不被其他动物捕食的“级”动物。物质和能量沿着食物链和食物网流动的。有毒物质沿食物链积累(富集)。生态系统具有一定的自动调节能力。(在一般情况下，生态系统中生物的数量和所占比例是相对稳定的。但这种自动调节能力有一定限度，超过则会遭到破坏。)例如：在草原上人工种草，为了防止鸟吃草籽，用网把试验区罩上，结果发现，网罩内的草的叶子几乎被虫吃光，而未加网罩的地方，草反而生长良好。原因是：食物链被破坏而造成生态系统平衡失调。生物圈是的生态系统。人类活动对环境的影响有许多是全球性的。生态系统的类型p29森林生态系统、草原生态系统、农田生态系统、海洋生态系统、城市生态系统等生物圈是一个统一的整体p30(富集)课本p26;课本p27页1题;注意DDT的例子p31 ; p33页生物圈2号生物的生存依赖于环境，以各种方式适应环境，影响环境。第二单元 生物和细胞 显微镜的结构镜座：稳定镜身;镜柱：支持镜柱以上的部分;镜臂：握镜的部位;载物台：放置玻片标本的地方。中央有通光孔，两旁各有一个压片夹，用于固定所观察的物体。遮光器：上面有大小不等的圆孔，叫光圈。每个光圈都可以对准通光孔。用来调节光线的强弱。反光镜：可以转动，使光线经过通光孔反射上来。其两面是不同的：光强时使用平面镜，光弱时使用凹面镜。镜筒：上端装目镜，下端有转换器，在转换器上装有物镜，后方有准焦螺旋。准焦螺旋：粗准焦螺旋(转动时镜筒升降的幅度大);细准焦螺(旋转动时镜筒升降的幅度大)。转动方向和升降方向的关系：顺时针转动准焦螺旋，镜筒下降;反之则上升显微镜的使用 P37-39观察的物像与实际图像相反。注意玻片的移动方向和视野中物象的移动方向相反。放大倍数=物镜倍数X目镜倍数 放在显微镜下观察的生物标本，应该薄而透明，光线能透过，才能观察清楚。因此必须加工制成玻片标本。观察植物细胞：实验过程P42-44切片、涂片、装片的区别 P42植物细胞的基本结构 (植物细胞图P45)细胞壁：支持、保护细胞膜：控制物质的进出，细胞质：液态的，可以流动的。细胞质里有液泡，液泡内的细胞液内溶解着多种物质(如糖分)细胞核：贮存和传递遗传信息叶绿体：进行光合作用的场所，液泡：细胞液观察口腔上皮细胞实验P47动物细胞的结构 (动物细胞图P48)细胞膜：控制物质的进出细胞核：贮存和传递遗传信息细胞质：液态，可以流动植物细胞与动物细胞的相同点：都有细胞膜、细胞质、细胞核植物细胞与动物细胞的不同点：植物细胞有细胞壁和液泡，动物细胞没有。细胞的生活需要物质和能量细胞是构成生物体的结构和功能基本单位。细胞是物质、能量、和信息的统一体。细胞通过分裂产生新细胞。细胞中的物质有机物(一般含碳，可烧)：糖类、脂类、蛋白质、核酸，这些都是大分子无机物(一般不含碳)：水、无机物、氧等，这些都是小分子细胞膜控制物质的进出，对物质有选择性，有用物质进入，废物排出。注意课本52页图叫什么细胞内的能量转换器：叶绿体：进行光合作用，是细胞内的把二氧化碳和水合成有机物，并产生氧。线粒体：进行呼吸作用，是细胞内的“动力工厂”“发动机”。二者联系：都是细胞中的能量转换器二者区别：叶绿体将光能转变成化学能储存在有机物中;线粒体分解有机物，将有机物中储存的化学能释放出来供细胞利用。动植物细胞都有线粒体。细胞核是遗传信息库，遗传信息存在于细胞核中(多莉羊的例子p55;p57页最后一段;p57页1题)细胞核中的遗传信息的载体——DNADNA的结构像一个螺旋形的梯子基因是DNA上的一个具有特定遗传信息的片断DNA和蛋白质组成染色体不同的生物个体，染色体的形态、数量完全不同同种生物个体，染色体在形态、数量保持一定染色体容易被碱性染料染成深色染色体数量要保持恒定，否则会有严重的遗传病细胞的控制中心是细胞核细胞通过分裂产生新细胞生物的由小长大是由于：细胞的分裂和细胞的生长细胞的分裂1、染色体进行复制2、细胞核分成等同的两个细胞核3、细胞质分成两份4、植物细胞：在原细胞中间形成新的细胞膜和细胞壁动物细胞：细胞膜逐渐内陷，便形成两个新细胞第三单元 生物圈中的绿色植物1、 蕨类植物出现根、茎、叶等器官的分化，而且还具有输导组织、机械组织，所以植株比较高大。2、孢子是一种生殖细胞。3、蕨类植物的经济意义在于：①有些可食用;②有些可供药;③有些可供观赏;④有些可作为优良的绿肥和饲料;⑤古代的蕨类植物的遗体经过漫长的年代，变成了煤。4、苔藓植物的根是假根，不能吸收水分和无机盐，而苔藓植物的茎和叶中没有输导组织，不能运输水分。所以苔藓植物不能脱离开水的环境。5、苔藓植物密集生长，植株之间的缝隙能够涵蓄水分，所以，成片的苔藓植物对林地、山野的水土保持具有一定的作用。6、苔藓植物对二氧化硫等有毒气体十分敏感，在污染严重的城市和工厂附近很难生存。人们利用这个特点，把苔藓植物当作监测空气污染程度的指示植物。7、藻类植物的主要特征：结构简单，是单细胞或多细胞个体，无根、茎、叶等器官的分化;细胞里有叶绿体，能进行光合作用;大都生活在水中。8、藻类植物通过光合作用制造的有机物可以作为鱼的饵料，放出的氧气除供鱼类呼吸外，而且是大气中氧气的重要来源。9、藻类的经济意义：①海带、紫菜、海白菜等可食用②从藻类植物中提取的碘、褐藻胶、琼脂等可供工业、医药上使用10、种子的结构蚕豆种子：种皮、胚(胚芽、胚轴、胚根)、子叶(2片)玉米种子：果皮和种皮、胚、子叶(1片)、胚乳11、种子植物比苔藓、蕨类更适应陆地的生活，其中一个重要的原因是能产生种子。12、记住常见的裸子植物和被子植物。第二章 第三单元 生物圈中的绿色植物1、种子的萌发环境条件：适宜的温度、一定的水分、充足的空气自身条件：具有完整的有生命力的胚，已度过休眠期。2、测定种子的发芽率(会计算)和抽样检测3、种子萌发的过程吸收水分——营养物质转运——胚根发育成根——胚芽胚轴发育成茎、叶，首先突破种皮的是胚根，食用豆芽的白胖部分是由胚轴发育来的4、幼根的生长生长最快的部位是：伸长区根的生长一方面靠分生区增加细胞的数量，一方面要靠伸长区细胞体积的增大。5、枝条是由芽发育成的6、植株生长需要的营养物质：氮、磷、钾7、花由花芽发育而来8、花的结构(课本102)9、传粉和受精(课本103)10、果实和种子的形成子房——果实 受精卵——胚胚珠——种子 子房壁----果皮(与生活中果皮区别)。11、人工受粉当传粉不足的时候可以人工辅助受粉。12、被子植物的生命周期包括种子的萌发、植株的生长发育、开花、结果、衰老和死亡。第三章 绿色植物与生物圈的水循环1、绿色植物的生活需要水(1)水分在植物体内的作用水分是细胞的组成成;水分可以保持植物的固有姿态;水分是植物体内物质吸收和运输的溶剂;水分参与植物的代谢活动(2)水影响植物的分布(3)植物在不同时期需水量不同2、水分进入植物体内的途径根吸水的主要部位是根尖的成熟区，成熟区有大量的根毛。3、运输途径导管：向上输送水分和无机盐筛管：向下输送叶片光合作用产生的有机物4、叶片的结构表皮(分上下表皮)、叶肉、叶脉、5、气孔的结构：保卫细胞吸水膨胀，气孔张开;保卫细胞失水收缩，气孔关闭。白天气孔张开，晚上气孔闭合。6、蒸腾作用的意义：可降低植物的温度，使植物不至于被灼伤是根吸收水分和促使水分在体内运输的主要动力可促使溶解在水中的无机盐在体内运输可增加大气湿度，降低环境温度，提高降水量。促进生物圈水循环。第四章 绿色植物是生物圈中有机物的制造者1、天竺葵的实验暗处理：把天竺葵放到黑暗处一夜，目的：让天竺葵在黑暗中把叶片中的淀粉全部转运和消耗。对照实验：将一片叶子的一半的上下面用黑纸片遮盖，目的：做对照实验，看看照光的部位和不照光的部位是不是都产生淀粉。脱色：几个小时后把叶片放进水中隔水加热，目的：脱色，溶解叶片中叶绿素便于观察。染色：用碘液染色结论：淀粉遇碘变蓝，可见光部分进行光合作用，制造有机物2、光合作用概念：绿色植物利用光提供的能量，在叶绿体中合成了淀粉等有机物，并且把光能转变成化学能，储存在有机物中，这个过程叫光合作用。3、光合作用实质：绿色植物通过叶绿体，利用光能，把二氧化碳和水转化成储存能量的有机物(如淀粉)，并且释放出氧气的过程。4、光合作用意义：绿色植物通过光合作用制造的有机物，不仅满足了自身生长、发育、繁殖的需要，而且为生物圈中的其他生物提供了基本的食物来源、氧气来源、能量来源。5、绿色植物对有机物的利用用来构建之物体;为植物的生命活动提供能量6、呼吸作用的概念：细胞利用氧，将有机物分解成二氧化碳和水，并且将储存在有机物中的能量释放出来，供给生命活动的需要，这个过程叫呼吸作用。7、呼吸作用意义：呼吸作用释放出来的能量，一部分是植物进行各项生命活动(如：细胞分裂、吸收无机盐、运输有机物等)不可缺少的动力，一部分转变成热散发出去。
目的: 构建用于rnai的shrna（small hairpin rna）表达载体及检测其对低氧诱导因子?1（hypoxia?inducible factor?1, hif1）基因的沉默效果。方法: 从人血基因组中pcr扩增出h1基因启动子, 克隆入酶切处理后的pegfp?c1载体片段中, 此载体命名为pwh1。以人hif1 cdna基因为靶标设计引物, 退火后克隆入pwh1。新的载体转染sgc7901细胞, 然后用rt?pcr和western blot检测hif1基因的表达改变。结果: 构建的pwh1载体能很好地表达针对hif1基因的shrna, rt?pcr和western blot的结果显示hif1基因的mrna和蛋白表达水平均明显下降。结论: 成功构建了shrna表达载体pwh1, 这对于基因的功能研究具有重要的意义。
【关键词】 shrna 表达载体 rna干涉 hif1基因
[abstract]aim: to construct the expression vector of small hairpin rna（shrna）and to test its efficacy in silencing the hypoxia?inducible factor?1 (hif1)gene. methods: the h1 gene promoter was amplified from the genome of the human blood cells by pcr. then the promoter was cloned into the pegfp?c1 vector digested with the restriction enzyme. the constructed vector was named pwh1. the primer was designed to target the human hif1 cdna gene. the annealed primer fragment was cloned into pwh1. the new constructed plasmid was transfected into the sgc7901 cell line. then the expression level of hif1 gene was assayed by rt?pcr and western blot. results: the newly constructed plasmid expressed shrna to target the hif1 gene.the results of rt?pcr and western blot showed the expression of hif1 gene was reduced dramaticaly in mrna and at protein level. conclusion: the successful construction of shrna expression vector (pwh1) provides a tool for further research into the function of a novel gene.
[keywords]shrna; expression vector; rna interference; hif1 gene
rna干涉(rna interference, rnai)是将双链rna（dsrna）导入细胞引起特异基因mrna降解的一种细胞反应过程。它是转录后基因沉寂（ptgs）的一种。1998年, fire等[1]在利用反义核酸技术来抑制线虫基因表达时意外地发现, 由正义和反义rna退火形成的dsrna引起的基因表达抑制要比单独应用正义或反义rna强10倍以上。dsrna引起的基因表达抑制不是正义或反义rna引起的基因表达抑制在数学上的叠加, 这就说明dsrna触发了细胞内的一些反应机制, 从而引起了高效和特异的基因表达抑制效果。当时, 他们就把这种现象命名为rnai。rnai的应用谱非常广泛, 从单细胞生物一直到人。其中研究最多的就是线虫, 其次就是果蝇。哺乳动物细胞的rnai应用研究并不象无脊椎动物那样进展得那么顺利。wianny等[2]将dsrna用显微注射的方法在小鼠胚胎成功进行了rnai。sayda等[3]用人工合成的21ntrna二合体在培养的哺乳动物细胞成功进行了rnai。brummelkamp等[4]利用载体表达的shrna在许多培养的人源, 猴源和鼠源的哺乳动物细胞的rnai实验中取得了成功。
在真核细胞内, rna聚合酶iii能指导短rna的表达和rna聚合酶iii结合的启动子有h1, u6等。目前, 这两种启动子都被尝试作为表达短rna的工具。本实验旨在克隆得到的h1启动子的基础上构建一个能稳定表达shrna的真核载体。然后针对hif1基因mrna设计靶标, 在培养的sgc7901细胞（胃癌细胞系）内进行rnai实验, 以观察新建的pwh1载体在基因沉默中的使用效率。这将为以后新基因的功能研究和基因治疗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 pegfp?c1质粒为clontech公司产品; 各种限制性内切酶为neb公司产品。t4连接酶、 pfu dna聚合酶和dl 2000 dna marker为takara公司产品。各种引物均由北京赛百盛公司合成。sgc7901细胞由全军消化病研究所保存。superscript ii反转录试剂盒购自invitrogen公司; 兔抗人hif1多抗、 兔抗人β?actin多抗和western blot luminol reagent为santa cruz公司产品。top10菌种由本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 以pegfp?c1为框架构建shrna表达载体pwh1 (1)用ase i和mlu i双酶切, 去掉pegfp?c1质粒上pcmv, egfp, mcs 和sv40polya等片段, 剩余的部分作为构建pwh1的框架。在ase i和mlu i之间加上一个接头dna序列, 该段接头dna由下面2条引物退火形成（退火温度: 39.5℃）: 序列1: 5′?taatggaattcgaagctta?3′; 序列2: 5′?cgcgtaagcttcgaattccat?3′。(2)通过pcr从人血细胞基因组dna获得h1 rna基因promoter[5]。取新鲜血液20 ml, 以1300 r/min离心15 min, 取淡黄层细胞（白细胞）重悬于15 ml抽提缓冲液（10 mmol/l triscl ph8.0, 0.1 mmol/l edta ph8.0, 20 mg/l胰rna酶, 5 g/l sds）, 37℃温育1 h。加蛋白酶k至终浓度为100 mg/l, 温和混匀。50℃水浴中放置3 h。冷却至室温后, 用等体积酚和氯仿抽提后, 加入0.2体积10 mol/l乙酸铵和2体积的乙醇, 放置30 min, 12000 r/min离心10 min。700 ml/l乙醇洗涤2次, 空气中晾干。加入1 ml te(ph8.0)溶解dna, 此即人血细胞基因组dna。以此dna为模板, pcr引物为: p1: 5′?ccatggaattcgaacgctgacgtc?3′(含ecor i位点); p2: 5′?gcaagcttagatctgtggtctcatacagaacttataagattccc?3′ (含hind iii, bgl ii位点)。 pcr产物通过ecor i和hind iii两个酶切位点克隆入puc19质粒, 进行序列验证。(3)pwh1载体的构建: pcr产物用ecor i和hind iii双酶切, 克隆入同样用这两种酶双酶切的上述框架载体。新载体命名为pwh1。
1.2.2 用pwh1进行沉默hif1基因的表达 (1)以人hif1 cdna基因为靶标的引物设计: 选取人hif1 cdna基因(genbank登录号: af304431)中的512～530核苷酸为靶标, 设计两条引物。序列如下: 引物1: 5′?gatcccctgaagtgtaccctaactagttcaagagactagttagggtacacttcatttttg?gaaa?3′; 引物2: 5′?agcttttccaaaaatgaagtgtaccctaactagtctcttgaactagttagggtacacttcaggg?3′。(2)构建针对hif1基因的shrna表达载体pwh1?hif1。将上面合成的两条引物用te（ph8.0）稀释成0.5 nmol/μl。各取5 μl混匀, 沸水中放置10 min, 缓慢冷却至室温4℃-20℃保存备用。用限制性内切酶bgl ii和hind iii对质粒pwh1做双酶切。用t4连接酶对pwh1质粒和退火产物进行连接。将连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。铺于含卡那霉素的lb平板上, 37℃培养24 h。挑取单克隆并提取质粒。用限制性内切酶ecor i和hind iii对候选阳性克隆质粒做双酶切鉴定。阳性克隆质粒命名为pwh1?hif1。（3）转染胃癌细胞系sgc7901: sgc7901细胞用rpmi1640培养液（含100 ml/l小牛血清）在37℃、 50 ml/l co2条件下培养。转染前24 h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板（瞬时）和24（稳定）孔板中, 贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照lipofectaminetm2000试剂说明书操作。于转染后48 h收集6孔板内细胞,做为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72 h按1∶10比例传代于60 mm直径培养皿中, 然后加入适量(400～1000 mg/l)g418进行筛选, 2周后挑取单个细胞集落, 扩大培养, 然后做为稳定转染细胞表型鉴定用。(4)rt?pcr检测hif1基因的mrna水平: 待6孔板内细胞生长至底面积90%～95%时, 收集细胞。参照gibco公司trizol?试剂使用方法提取细胞rna, 溶于20 μl depc水内。用superscripttm ii rt kit参照其使用说明进行cdna第1条链的合成。人β?actin内对照引物: p1: 5′?ggccgggacctgactgactac; p2: 5′?tctttgcggatgtccacgtc（长度331 bp）。人hif1 rt?pcr引物: p3: gatctcggcgaagtaaag?aatctg; p4: agaaaatttcatatccaggctgt（长度680 bp）。pcr反应条件: 95℃ 1 min(94℃ 40 s; 56℃ 40 s; 72℃ 40 s)×26 cycle; 72℃ 10 min; 4℃保存。(5)western blot检测hif1的蛋白水平: 已处理的转染细胞样品经sds?聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 100 伏转移3 h至nc膜上, 50 g/l脱脂奶粉室温封闭2 h, 依次加入1∶2500稀释的兔抗人一抗4℃孵育过夜, 1∶5000稀释的hrp标记的鼠抗兔二抗作用2 h, 加入luminol试剂, 并以x?光片捕捉hrp催化luminol试剂所产生的激发光。
2 结果
2.1 shrna表达载体pwh1构建的实验结果
2.1.1 从人血细胞基因组dna中扩增得到h1 rna基因promoter pcr反应体系: dna模板2 μl, p11 μl, p21 μl, taq 0.5 μl, dntp 2 μl, 10×buffer 5 μl, h2o 38.5 μl, 总体积50 μl。pcr反应条件为: 94℃ 5 min(94℃ 30 s; 45℃ 45 s; 72℃ 30 s)×5 cycle; (94℃ 30 s; 56℃ 45 s; 72℃ 30 s)×25 cycle; 72℃ 2 min; 4℃保存。10 g/l琼脂糖凝胶电泳后, 在250 bp左右可以见到一扩增条带(图1), 大小与理论预计一致。
图1 h1基因启动子的pcr扩增电泳结果（略）
fig 1 age analysis of pcr products encoding h1 gene promoter
m: dna marker dl 2000; 1: pcr of h1 gene promoter.
2.1.2 重组质粒puc19?h1的酶切鉴定 上述pcr产物经ecor i和hind iii双酶切后, 克隆入puc19载体。阳性克隆命名为puc19?h1（图2）。puc19?h1质粒递交上海生工公司测序, 结果显示, 与genbank的h1基因启动子序列（登录号: x16612）完全一致。
图2 重组质粒puc19?h1的酶切鉴定结果（略）
fig 2 age analysis of recombinant plasmid puc19?h1 digested with ecor i and hind iii
m: dna marker dl 2000; 1, 2: puc19? h1.
2.1.3 pwh1双酶切鉴定 pegfp?c1质粒经ase i和mlu i双酶切后, 加上一段由2条引物退火形成的接头dna, 此框架质粒命名为pwk。再利用接头上带有的ecor i和hind iii酶切位点将puc19?h1质粒上的目的片段亚克隆到这个框架质粒上。新的质粒命名为pwh1(图3)。
图3 pwh1质粒的酶切鉴定结果（略）
fig 3 age analysis of plasmid pwh1 digested with ecor i and hind iii
m: dna marker dl 2000; 1: pwk; 2: pwh1.
2.2 pwh1?hif1的酶切鉴定结果 将合成的2条引物退火后, 从bgl ii和hind iii两个酶切位点克隆到质粒pwh1。新的质粒命名为pwh1?hif1。用ecor i和hind iii对pwh1?hif1进行双酶切鉴定（图4）, 阳性克隆切下约310 bp片段, 阴性克隆切下约250 bp片段。
图4 pwh1?hif1质粒的酶切鉴定（略）
fig 4 age analysis of recombinant plasmid pwh1?hif1 digested with ecor i and hind iii
m:dna marker dl 2000; 1: pwh1?hif1; 2: pwh1.
2.3 pwh1?hif1瞬时转染sgc7901细胞 将准备好的pwh1?hif1质粒5 μg用脂质体方法转染入sgc7901细胞, 48 h后收集细胞。用trizol?试剂抽提细胞rna, 进行rt?pcr。12 g/l琼脂糖凝胶电泳结果（图5）可以看出, rnai后和对照组相比mrna被明显降解。
图5 pwh1?hif1瞬时转染sgc7901细胞后的rt?pcr结果（略）
fig 5 rt?pcr result of sgc7901 cells transient transfected with pwh1?hif1
m: dna marker; 1: sgc7901; 2: sgc7901transfected with pwh1; 3: sgc7901 transfected with pwh1?hif1.
2.4 pwh1?hif1稳定转染sgc7901细胞 将准备好的pwh1?hif1质粒2 μg用脂质体方法转染入sgc7901细胞, 按有限稀释法挑取单克隆细胞。用trizol?试剂抽提细胞rna, 进行rt?pcr。12 g/l琼脂糖凝胶电泳结果（图6）可以看出, rnai后和对照组相比mrna被明显降解。
图6 pwh1?hif1稳定转染sgc7901细胞后的rt?pcr结果（略）
fig 6 rt?pcr result of sgc7901 cells stable transfected with pwh1?hif1
m: dna marker; 1: sgc7901 transfected with pwh1?hif1; 2: sgc7901 transfected with pwh1; 3: sgc7901.
2.5 western blot检测hif1基因的rna干涉效果 挑取3个稳定转染pwh1?hif1质粒的sgc7901单克隆细胞。用抗hif1抗体进行western blot和化学发光显色（图7）可见, rnai后和对照组相比hif1的蛋白表达水平明显下降。
图7 pwh1?hif1稳定转染sgc7901细胞后的western blot结果（略）
fig 7 western blot result of sgc7901 cells stable transfected with pwh1?hif1
1-3: 3 sgc7901 cell clones transfected stably with pwh1?hif1; pwh1: sgc7901 cell clone transfected stably with pwh1.
3 讨论
rnai一经发现, 立即成为科学研究的一大热点。这是因为rnai这个生物领域的新兴事物, 本身具有它的神秘性, 同时又具有广阔的应用前景[6]。rnai已经被应用到线虫的系统基因组研究上, rnai作为一个工具, 它的应用范围可以从单细胞的原生动物一直扩展到人。使哺乳动物细胞产生特定基因的功能丧失表型, 对于新基因功能研究、 新蛋白质药物的开发和基因治疗等方面都具有重要的意义。本实验构建的pwh1载体, 能在真核细胞内表达shrna, shrna可以有效模仿sirna, 使目标蛋白的mrna发生特异性的降解。pwh1可被广泛用于真核细胞的rnai实验模型。
缺氧诱导因子1(hif1)是机体细胞在低氧环境中产生的一种结合dna蛋白质因子, 在低氧信号中起到一个重要的中介作用, 通过转录水平参与对低氧反应基因的调控, 从而使机体对低氧刺激作出复杂的病理生理反应［7］。hif1在多种肿瘤中广泛存在, 它与一系列缺氧反应靶基因上的特定结合位点?缺氧反应元件(hypoxia response element, hre)结合, 从而启动靶基因的转录表达, 同肿瘤的增殖、 转移密切相关［8］。talks等[9]发现大多数恶性肿瘤细胞中有hif?1表达, 且hif?1在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞系sgc?7901中利用所构建的pwh1载体成功降低了hif1基因的表达, 这对研究胃癌的发生、 增殖、 多药耐药和治疗等均有重要的意义。
【参考文献】
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[关键词]牙龈卟啉单胞菌；提取物；人牙周膜细胞；活性
[中图分类号]Q 256[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.02.008
Effects of sonicated extracts of Porphyromonas gingivalis on the viabilities of human periodontal ligament cellsFeng Qin, Zhang Fengqiu, Sun Zheng.（Dept. of Periodontics and Mucosa Disease, The Affiliated Beijing Stomatological Hospital of Capital Medical University, Beijing 100050, China）
[Abstract]ObjectiveTo evaluate the effects of sonicated extracts of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis）on the viabilities of human periodontal ligament cells（hPDLC）. MethodsIn the experimental group, hPDLC obtained by the tissue culture were treated by sonicated extracts in different concentrations（6.25, 12.5, 25, 50 mg·L－1）for 24 hours. In the negative control group, hPDLC were treated without sonicated extracts. Furthermore, hPDLC were exposed to 12.5 mg·L－1sonicated extracts for 24, 48, 72 and 96 h, while hPDLC in the negative group were cul -tured for 24, 48, 72 and 96 h without sonicated extracts. Cell viabilities in two groups were determined by methyl thiazolyl tetrazolium method and use SPSS 13.0 package for one-way analysis of variance and independent sample t-test. ResultsSonicated extracts for hPDLC as the concentration of 6.25-50 mg·L－1, exposed for 24h, the hPDLC viabilities of experimental group were lower than those of the negative group. When hPDLC were exposed to 12.5 mg·L－1sonicated extracts, in the 24-96 h, the hPDLC viabilities of experimental group were lower than those of the control group. ConclusionPorphyromonas gingivalis can lead to decreased viabilities of hPDLC in vitro, in a dose and time dependent.
[Key words]Porphyromonas gingivalis；extract；human periodontal ligament cell；viability
牙龈卟啉单胞菌是革兰阴性、专性厌氧的产黑色素杆菌，是牙周炎最重要的病原菌[1]，含有大量的毒力因子，如菌毛、牙龈素、脂多糖和细胞外小泡（extracellular vesicle，ECV）等[2]。牙龈卟啉单胞菌超声提取物（以下简称提取物）的致病成分和牙龈卟啉单胞菌相类似，也包含有脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、细胞外膜蛋白、牙龈素、菌毛和ECV等[3-5]，因此，人们常用其提取物来研究牙龈卟啉单胞菌的致病作用。
甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色是一种检测细胞存活和生长的方法。本试验采用体外细胞培养法，以未处理细胞作为阴性对照组，提取物作用的细胞为试验组，应用MTT比色检测提取物在不同时间和不同质量浓度时对于人牙周膜细胞（human periodontal ligament cell，hPDLC）生长活性的影响。
1材料和方法
1.1主要仪器与试剂
达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum essential medium，DMEM；杭州吉诺公司），胎牛血清（Gibco公司，美国），MTT（Solarbio公司，美国），CO2恒温孵箱（Heraeus公司，德国），倒置相差显微镜（inverted phase contrast microscope，IPCM；Olympus株式会社，日本），酶标仪（Sun－nyvale公司，美国）。
1.2提取物
提取物由北京大学口腔医院欧阳翔英教授惠赠。提取物的制备过程为：于标准厌氧环境之中培养牙龈卟啉单胞菌，收集菌落，以超声仪粉粹细菌后离心，收集其上清液，冻干备用[3]。
1.3人牙周膜细胞的原代培养
将就诊于首都医科大学附属北京口腔医院外科门诊18～28岁患者因正畸需要拔出的健康恒牙或第三磨牙，浸泡于生理盐水中并迅速送往试验室。于超净台上采用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3次，在培养皿内加入2滴PBS，以手术刀片于无菌条件下刮取牙根中1/3段的牙周膜组织，在PBS浸润下用眼科剪将牙周膜组织剪碎，然后将其移入6孔板内，加入2 mL含体积分数20%的胎牛血清，10万U·L－1青霉素和100 mg·L－1链霉素的DMEM。最后将6孔板放入培养箱中，在37℃，体积分数5%CO2和95%空气的条件下培养。3 d后换液。
1.4人牙周膜细胞的传代培养
待组织块周围细胞生长密集后倒掉培养液，PBS冲洗细胞2次，滴加质量浓度2.5 g·L－1的胰蛋白酶1 mL，轻轻晃动6孔板，使胰蛋白酶液流遍所有细胞表面，镜下观察。待细胞质回缩，细胞间隙增大，部分细胞悬浮后，立即加入3 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM，终止消化，离心，去上清液，培养瓶内培养。传代后每3天换液1次，细胞相互融合成片达80%后，按1∶2的个数比例继续传代，传至5～6代备用。
1.5提取物对hPDLC的作用
将hPDLC接种于96孔板，当细胞铺满板底时，试验组加入提取物，使培养基中提取物的质量浓度分别为6.25、12.5、25、50 mg·L－1，阴性对照组则不加入提取物。然后将细胞置于37℃、体积分数5%CO2的条件下培养24 h，用酶标仪检测细胞活性。
1.6提取物对hPDLC作用的时间
用12.5 mg·L－1的提取物作用于试验组，阴性对照组则不加入提取物，将细胞置于37℃、体积分数5%CO2条件下培养24、48、72和96 h，用酶标仪检测各时间段细胞的活性。试验组与对照组均设置3个平行孔，设与试验平行且不加细胞只加培养液的空白对照组，最后比色时，以空白组调零。以上试验均重复3次。
1.7MTT比色检测各组细胞的活性
分别在相应的时间点加入MTT液，然后用酶标仪检测各组细胞的活性。具体操作如下：向需要检测的培养孔内加入质量浓度为5 g·L－1的MTT液20μL，37℃孵箱中继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清液。每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解。波长选择490 nm，在酶标仪上测定各孔光密度值（D490），记录结果。以时间为横轴，D490值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.8统计学分析
数据以SPSS 13.0行单因素方差分析和独立样本t检验，结果用x±s表示，P＜0.05为组间差异有统计学意义。
2结果
2.1hPDLC的体外培养
倒置相差显微镜下观察活细胞形态：细胞胞体为长梭形或星形，透明度大，细胞质丰满；细胞核圆形或椭圆形，位于细胞中央，内含2～3个核仁；细胞较多时排列成束状，呈漩涡状或放射状分布（图1）。
2.2不同质量浓度提取物对hPDLC活性的影响
6.25、12.5、25、50 mg·L－1的提取物作用于hPDLC 24 h，酶标仪的D490值分别为0.435±0.012、0.430±0.021、0.385±0.021、0.315±0.019，各质量浓度组的D490值均低于阴性对照组D490值0.490±0.030。随着提取物质量浓度的增加，hPDLC活性逐渐降低。单因素方差分析比较各组显示，试验组与阴性对照组间差异有统计学意义，6.25mg·L－1组与12.5 mg·L－1组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义。
2.3不同作用时间提取物对hPDLC活性的影响
12.5 mg·L－1的牙龈卟啉单胞菌超声提取物作用于hPDLC后24、48、72、96 h，酶标仪的D490值如表1所示。在各时间点，提取物作用组的hPDLC活性低于阴性对照组（图2），即在各时间点，提取物对hPDLC的活性具有抑制作用。行独立样本t检验，两组在各时间点间的差异有统计学意义（P＜0.05）。
3讨论
牙周炎引起牙周围支持组织的破坏，导致牙松动、脱落。牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周炎最重要的病原菌，与牙周炎的发生、治疗后复发或病情加重密切相关。侯建霞等[3]曾在研究中发现，相对于健康对照组而言，1、10、100 mg·L－1质量浓度的提取物均可明显地抑制人牙周膜干细胞的增殖。本研究不仅证实了牙龈卟啉单胞菌对人牙周膜细胞的活性及增殖有抑制作用，而且其抑制作用具有时间和质量浓度依赖性。
牙龈蛋白酶是一组存在于牙龈卟啉单胞菌外膜、小泡或细胞外的蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶，是牙龈卟啉单胞菌重要的毒力因子。在牙周炎的发展过程中，牙龈蛋白酶在宿主细胞定植、免疫系统破坏及组织破坏中发挥重要作用[6]。牙龈蛋白酶活性提取物作用于人微血管内皮细胞16 h之后，培养皿内的细胞几乎全部出现附着丧失，24 h后出现程序性细胞死亡[7]。当牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶的质量浓度大于100 mg·L－1时，作用24 h后，牙周膜细胞几乎全部程序性死亡[8]。上述研究结果说明，牙龈蛋白酶对细胞有毒性作用，可破坏细胞内蛋白质如细胞骨架，或影响信号传导通路引起程序性细胞死亡。
LPS是牙龈卟啉单胞菌外膜中的主要成分，是引起炎症的重要因素之一，可激活细胞产生促炎因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α，白细胞介素（interleukin，IL）-1和6。牙周炎局部组织的破坏很多都归结于宿主对病原菌的炎性反应[9]。炎性细胞因子在消除病原菌的同时也可促进宿主组织的破坏，如IL-1β和TNF-α在猴试验性牙周炎组织破坏和骨吸收过程中起了关键性的作用[10]。研究[11]显示，LPS通过CD14的介导，激活人牙龈成纤维细胞产生IL-6。另有研究[12]显示，10、100 mg·L－1质量浓度的LPS可明显地抑制牙周膜细胞增殖，而0.01、0.1 mg·L－1质量浓度的LPS则促进牙周膜细胞增殖。即LPS在低质量浓度时的促进细胞生长，可能是机体的一种防御反应。还有研究[13]显示，10 mg·L－1质量浓度以上的LPS可使人口腔上皮细胞、牙龈成纤维细胞、单核-巨噬样细胞等靶细胞在短时间内死亡。上述研究证实，LPS作为一种潜在的细胞激活因子，通过细胞表面的CD14受体，可激活牙周组织中多种细胞产生细胞因子和炎症递质，直接或间接地作用于宿主细胞，引起程序性细胞死亡和组织破坏。
菌毛在牙龈卟啉单胞菌和宿主细胞之间的相互黏附中起着关键性的作用[14]，而且与该菌侵入牙周组织上皮细胞和结缔组织内有关，可以刺激TNF-α和集落生成因子以及IL-1、6、8的产生[15]。ECV位于菌体细胞的表面或分泌于培养上清液中，50 mg·L－1质量浓度的ECV即对牙周膜成纤维细胞的增殖活性有明显的抑制作用[16]。菌毛有利于牙龈卟啉单胞菌侵入细胞并刺激细胞产生炎性因子，而ECV内含有的毒性因子，可通过各自的作用机制作用于细胞，对细胞的活性产生影响。
本研究以提取物作为人牙周膜细胞的刺激因子，模拟活菌对人牙周膜细胞活性的影响。提取物的致病成分和牙龈卟啉单胞菌的相同，因此可代表牙龈卟啉单胞菌的致病性。与采用活菌作为刺激物的方法相比较，此方法的优点在于对刺激物的量更容易控制，操作更加简便、精确。
4参考文献
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作者：韩兆东 阮月芹 安新业 孔祥华 陈佳荣 周玉明
【关键词】 细胞
【关键词】 流式细胞仪；临床应用；流式细胞术
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的综合结晶。在免疫学、血液学、肿瘤学等学科及临床研究方面得到广泛应用［1］。
FC500是由美国贝克曼库尔特（BECKMAN COULTER）公司2003年推出的临床及科研型流式细胞仪系统。该仪器可同时测定前向散射光（FORWARD SCATTER）、侧向散射光（SIDE SCATTER）及利用一个488 nm单束激光激发五个荧光染科所产生的荧光信号。因此，该仪器可对各个细胞进行相关的多参量的分析。
FCM的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞的分子水平的研究，随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。
1 FCM在免疫学中的应用
FCM广泛地应用于检测各种免疫细胞的表面标志及细胞内各种细胞因子等，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，指导治疗。有大量文献介绍了淋巴细胞在各种疾病中的变化。正常人群T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例下降甚至倒置。B细胞CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反应机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。FCM通过对人白细胞抗原（HLA）配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测。外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性，运用HLAB27/HLAB7双标记特异性单克隆抗体检测抗原，可同时排除交叉反应，其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高［2］。用FCM检测阵发性睡眠性血红蛋白尿患者血细胞细胞膜上的CD55、CD59已能从病理上提供直接的证据，比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。用FCM检测红细胞、粒细胞抗体及血小板表面的相关抗体，对确诊自身免疫性贫血、粒细胞减少症及血小板减少性疾病，均具有检测速度快、灵敏度高、特异性好的优点［2］。
2 FCM在血液学中的应用
白血病分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充；是对白血病诊断、选择化疗方案和判断预后的重要依据；对白血病发病机制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面及浆内表达不同的分化抗原，且与相应正常骨髓细胞的表达存在差异，故应用FCM能很好的对白血病进行免疫分型，并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。这使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识。FCM还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，包括先天性或获得性血小板的疾病，评价活化血小板程度在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。用FCM通过对外周血网织血小板的测定，有助于血小板减少症的病因学诊断。可作为骨髓移植、造血促进因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢复有用的监控指标。
应用FCM检测某些免疫指标，能对再生障碍性贫血的发病机制进行研究。再障是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征。其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验室证据表明免疫介导的造血抑制，是再生障碍性贫血最常见的病理之一。而且，具有免疫表型异常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T细胞或TCRγ，δ等异常增高）的患者临床表现相对严重，但免疫治疗相对有较好的疗效。
微小残留病灶（MRD）检查：白血病病人在获得血液学缓解后，体内还存在1010以下的白血病细胞。这样少量的白血病细胞常规的显微镜不能检出。在强化治疗和维持治疗后可逐步减少，但难以彻底清除，这是复发的根源。检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及异基因骨髓移植时机的依据。
多发性骨髓瘤（MM）：多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病，正常浆细胞为CD38+/CD45 dim-，使用CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通过为CD19-/CD56+。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估有重要意义。
CD34的绝对计数：造血干/祖细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治性疾病的有效方法；它不仅可以用于某些恶性血液病的治疗，而且还可以用于其他恶性实体瘤的治疗。骨髓移植（BMT）或外周血造血干细胞移植（PBSCT）的成功与否，除了与是否合并并发症有关外，移植物中CD34+细胞的数量和质量是快速成功植活的重要因素。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择GCSF动员外周血干细胞的采集时间，有着重要指导意义。
3 FCM在肿瘤学中的应用
流式细胞术利用实体瘤标本或穿刺标本、胸腹腔液体、膀胱冲洗液、尿液、食道镜及支气管镜钳取的少量活检组织等对肿瘤细胞DNA会计师测定，解析细胞周期，通过肿瘤细胞异倍体测定，鉴别良性与恶性肿瘤，预测各种癌的预后，并能在化疗中对药物的选择，放疗中强度、时间的决定等起主要作用［5］。根据细胞周期分析结果，适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物，可协助拟定治疗方案；根据化疗过程中肿瘤细胞DNA会计师分布直方图的变化，可了解细胞动力学变化，以此评估药物疗效。
多药耐药（MDR）的研究：白血病治疗及肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于白血病细胞及肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药。因此，对白血病和肿瘤细胞耐药机制的研究具有重要的意义。但耐药的形成过程很多，主要有几个方面，包括药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。多药耐药基因编码的P糖蛋白，是白血病细胞及肿瘤细胞抗药性的分子学基础，也是影响化疗疗效的主要障碍。利用FCM检测多药耐药基因，则可为药理学研究提供依据。
参 考 文 献
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2单卫民，冯萍，俞秋兴流式细胞仪检测HLAB27［J］临床检验杂志，2000，18（6），366
3Jennnings CD，Foon KARecent advances in flow cytometry;application to the diagnosis of hematologic malignancy［J］Blood，1997，90(8);2863
【关键词】 二氧化硫
SO2被吸收进入体内后，首先在体液中转化成为它的代谢衍生物-亚硫酸盐和亚硫酸氢盐(分子比为3∶1)。SO2对动物和人的作用，实质上是通过这些体内衍生物对组织、细胞及生物大分子的损伤而达到的〔1，2〕。而细胞内许多抗氧化酶活性的改变和膜脂质过氧化的损伤一直被认为是许多毒物的作用机制之一。本室研究表明，SO2吸入可引起大鼠脑组织和红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性下降、脂质过氧化(LPO)作用增高〔3，4〕。SO2与人类健康关系密切，对其毒作用机制及防护研究非常重要。因此，本文研究了SO2体内衍生物对中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)中过氧化氢酶(CAT)、SOD酶活性及LPO水平的影响以及抗坏血酸(维生素C，VC)的保护作用。
1 材料与方法
11 实验材料 CHL细胞（中国军事医学科学院提供）。
12 细胞培养 本实验所用CHL细胞在含5％CO2，37℃恒温箱中培养。用以细胞培养的RPMI 1640(美国Gibco公司）培养液中含10％小牛血清，青霉素100Iu／ml，链霉素100μg／ml，传代时以02％胰酶液消化。
13 药物处理
131 SO2衍生物处理 细胞传代，培养12h后进行药物处理：对照组5ml／瓶磷酸缓冲液，实验组分别用亚硫酸盐溶液处理，浓度分别为5，10，15，20mmol／L，4h后，弃去处理液。用磷酸缓冲液洗涤细胞，换上新鲜培养液，细胞仍置于5％CO2，37℃恒温箱中培养。分别在12，24h取上清液用于脂质过氧化水平测定；并分别在12，24，36，48h取各组细胞消化，1250r／min离心10min，加入5ml超纯水溶解细胞，置-80℃冰箱中，冻融二次，取出并破碎细胞，进行酶活性测定。
132 VC处理 细胞传代，培养12h后进行药物处理：对照组5ml／瓶磷酸缓冲液，实验组分别用不同剂量VC和磷酸缓冲液处理，VC剂量分别为005，01，025，05mmol／L，4h后，弃去处理液。将其分为3组，1组细胞经消化、离心、破碎后立即测定酶活性；另外2组用磷酸缓冲液洗涤细胞，换上新鲜培养液，将细胞置于5％CO2，37℃恒温箱中培养。分别在12，24h取上清液测定脂质过氧化水平，并测定各组细胞酶活性。
133 SO2衍生物和VC处理 细胞传代，培养12h后进行药物处理，先用01mmol／L的VC处理15min后，加入不同剂量的SO2衍生物，浓度为5，10，15，20mmol／L，4h后，弃去处理液，分别在12，24h测定脂质过氧化水平和酶活性。
14 CAT活性测定 采用过氧化氢(H2O2)分解反应的一级速率常数来测定CAT的活性〔5〕。即在一定的时间间隔Δt内测定H2O2在240nm处的吸光度A1、A2，并用下列公式计算：K/g蛋白质=23／Δt(a／b×lgA1/A2）(Sec-1)。式中：K-速率常数；Δt-时间间隔；a-稀释倍数；b-溶液中蛋白质含量；A1、A2分别-时间t1、t2时的吸光度。
15 SOD活性测定 采用改进的VC终止法，420nm测A值〔3，4〕。邻苯三酚自氧化率的A值控制在006～007／min。SOD活性以单位／mg(蛋白质)(U／mg protein)表示。
16 脂质过氧化作用的测定 通过测定硫代巴比妥酸反应物（TBARS)的水平，以1，1，3，3-四乙氧基丙烷为标准，计算脂质过氧化产物-TBARS的含量〔3，4〕。主要步骤为：在样品反应管中加入4ml 10％三氯乙酸，16ml 067％硫代巴比妥酸(TBA)，细胞上清液04ml，在95～100℃保温40min，水浴冷却后，3000r／min离心10min，取上清液在532nm测A值。
17 蛋白质含量测定 采用Lowry法进行蛋白质含量的测定〔3，4〕。
18 统计分析 应用t检验法检验实验组与对照组之间的差异。
2 结果
21 SO2衍生物对CHL细胞CAT活性的影响(表1) 如表1所示，实验组细胞在12，24h时酶活性都显著降低。其中5mmol／L组随着时间的延长，细胞酶活性逐渐恢复。而10，15，20mmol／L组细胞却随时间延长而降低，在36h时酶活性显著降低。在48h时，酶活性有所回升，5，10mmol／L组已分别恢复到对照组的93％和83％，15和20mmol／L组也比36h时稍有升高，但与对照组比较，差异有统计学意义(P
表1 不同浓度SO2衍生物对CHL细胞CAT活性的影响（略）
注：a P
22 VC对CHL细胞CAT活性的影响 在VC处理4h后弃去处理液，立即测定CAT活性，0，005，01，025，05mmol／L组的计算值分别为(0060±0，002），（0060±0000)，（0063±0004），（0058±0001），（0059±0001），实验组与对照组比较，差异无统计学意义；继续培养12h后，CHL细胞CAT活性明显升高，5个剂量组的计算值分别为（0059±0001），（0065±0001），（0072±0002），(0066±0005），(0068±0005），实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P
23 VC对SO2衍生物引起的CHL细胞CAT活性变化的干预(表2) 如表2所示，VC和SO2衍生物共同作用后，CAT活性仍然呈下降趋势。但在培养12h的细胞中，加入VC的5，10mmol／L组都显著高于未加VC组的CAT活性；在培养24h的细胞中，10，15mmol／L组与未加VC组差异有统计学意义(P
表2 VC对SO2衍生物引起的CHL细胞CAT活性变化的干预（略）
注：与阴性对照组比较，a P
24 CHL细胞中SOD的测定 本实验中，对照组和SO2衍生物处理组均未能检测到SOD的存在。这可能是由于CHL细胞中没有SOD，也可能是由于含量低而无法用本实验的方法检测。
25 SO2衍生物对CHL细胞脂质过氧化的影响（表3） 如表3所示，SO2衍生物处理后细胞脂质过氧化水平均有增高，处理12h时10，15mmol/L与对照组比较，差异有统计学意义，20mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义(P
表3 VC对SO2衍生物引起的CHL细胞LPO变化的干预（略）
注：与阴性对照组比较，a P
26 VC对SO2衍生物引起的CHL细胞LPO变化的干预 如表3所示，VC和SO2衍生物共同作用后，12和24h时各组细胞脂质过氧化水平随SO2衍生物浓度增高仍然呈上升趋势，且12h时，15和20mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义（P
27 VC对CHL细胞脂质过氧化的影响 VC处理12h时，CHL细胞脂质过氧化水平均有不同程度的降低，0，005，01，025，05mmol／L组的计算值分别为（0387±0002)，(0376±0017)，(0328±0015)，(0356±0005)，(0376±0011)nmol／ml，且010，025mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义(P
3 讨论
SO2进入体内后，主要以SO2-3和HSO-3的形式发挥其生物学作用。而后者极易形成三氧化硫阴离子自由基(SO- ·3)，进而形成过氧自由基(O-2）、羟自由基(OH·)等〔6〕。CAT中含有巯基(-SH)，易受自由基攻击〔7，8〕，自由基还攻击生物膜使不饱和脂肪酸发生过氧化〔9〕。本实验以SO2代谢衍生物对CHL细胞进行处理后，发现CAT活性降低，LPO水平增高，呈现一定的剂量-效应关系。从而进一步验证了SO2的自由基损伤学说〔10〕。本实验未能检测到SOD，其原因有待进一步研究。Etlik Ozdal等研究表明，VC、维生素E（VE）对SO2引起的红细胞脂质过氧化有保护作用〔11〕。本实验研究发现，VC单独处理后，各组CAT活性只在12h时显著升高，同时LPO水平降低，但是只有010，025mmol／L组与对照组比较，差异有统计学意义。可见，一定剂量的VC在一定时间范围内可以增强CHL细胞抗氧化酶的活性，并降低其脂质过氧化水平。VC和SO2共同作用后，CAT活性仍然呈下降趋势，但添加VC的组CAT活性普遍高于相应的未加VC组，且培养12h时5，10mmol／L组及24h时10，15mmol／L组与未加VC差异有统计学意义，且VC也降低了SO2衍生物引起的LPO水平，且12h时10，15，20mmol／L组比未加VC组有显著降低。说明VC对SO2衍生物所造成的CAT活性降低和LPO水平增高有一定的影响作用。
参考文献
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