RT-PCR检测耐药相关基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表达取对数生长期细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，SYBYGreen方法进行实时荧光定量PCR实验。引物设计由Invitrogen公司合成，见表1。PCR反应体系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的终浓度各为15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循环设置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40个循环（生成扩增曲线）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲线）。SDS2.2软件分析处理数据，管家基因校正目的基因的表达，得到相对定量结果。1.6耐药细胞的保存耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存于含0、10、30nmol/L紫杉醇药物的冻存液里。于冻存后1、3、6月分别复苏细胞，观察复苏情况，MTT法检测IC50。1.7统计学方法对有关数据采用SPSS13.0软件进行独立样本t检验（independentsamplet-test）、单因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1耐药细胞的建立
SKOV3经300μg/ml大剂量的紫杉醇作用2h后,大部分细胞死亡漂浮，剩余细胞肿胀，伸出树枝状突起呈蜘蛛状，胞质见空泡形成、颗粒增多。少量存活的细胞克隆生长，恢复生长至对数期消化传代，再进行下一次冲击；SKOV3经10~30nmol/L小剂量的紫杉醇作用24h，约50%的细胞死亡，细胞体积增大，形态不规则，胞质内颗粒增多，贴壁性变弱，给药24~72h内最明显，96~120h后逐渐恢复原状。经两种诱导方法获得的耐药细胞系，分别命名为SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐药细胞的生物特性
2.2.1耐药指数MTT实验结果显示，耐药细胞及其敏感细胞的IC50值及耐药指数，可见小剂量浓度递增诱导的耐药细胞SKOV3/TAX30耐药性较强，见表2。2.2.2平板克隆形成实验在无药物作用时，SKOV3敏感细胞较两种耐药细胞系的克隆形成能力强，见图1A的d组，SKOV3敏感细胞的克隆形成数为（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成数为（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成数为（579±9.50）。与敏感细胞SKOV3相比，两种耐药细胞克隆形成数少，差异有统计学意义（P均=0.000），见图1B。而在相同浓度紫杉醇作用下，耐药细胞形成的克隆明显多于敏感细胞。在紫杉醇浓度为5nM时，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）个克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）个克隆，而SKOV3形成的克隆数仅（202±6.08），差异有统计学意义（P均=0.000）；当紫杉醇浓度进一步升高为50nM和500nM时，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆数仍明显高于敏感细胞SKOV3。紫杉醇浓度为50nM时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.013）,SKOV3细胞与SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异也有统计学意义（P=0.000）；紫杉醇浓度为500nmol/L时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.009、0.0001），见图1B。2.2.3生长曲线倍增时间的差异SKOV3敏感细胞和两种耐药细胞系在相同条件下培养7天，细胞增殖产生一定的差异。耐药细胞的生长较敏感细胞减慢，生长曲线的斜率减小，见图2。同时，根据生长曲线计算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞的倍增时间分别为28.90h、24.0h，与敏感细胞的倍增时间20.84h相比也有所延长。
2.3耐药相关基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各细胞中的表达MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞中的相对表达丰度见图3A、3B。两种耐药细胞中，MDR1的表达明显增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30对紫杉醇的耐药与MDR1高表达有关。SKOV3/TAX300细胞中PRKCA、LRP的表达均高于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表达与敏感细胞比较，差异无统计学意义（P=0.815）。而SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表达低于敏感细胞（P=0.001），见图3B。以上数据表明不同诱导方式导致耐药细胞发生不同生物学变化，可能存在不同的耐药机制。
2.4耐药细胞的保存
耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存在含有0、10、30nM紫杉醇的冻存液中，于冻存后1、3、6月复苏，检测IC50，见表3。1、3月后检测结果提示，在3种药物浓度条件下的细胞IC50没有明显区别，但冻存6月后，无药冻存组的耐药细胞与两种加药冻存组的细胞比较，其IC50明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。同一个药物浓度条件下，无药冻存组的耐药细胞在冻存6月时，出现耐药性下降，而两种加药冻存组细胞在6月的冻存过程中，细胞IC50虽然出现轻度下降，但差异无统计学意义。
3、讨论
3.1耐药细胞的建立
本实验结果提示：增加给药剂量、适当延长无药间歇期，可能延缓细胞的耐药性。由于大剂量冲击诱导与临床治疗模式相似，临床上体内耐药指数≥2倍即足以导致化疗失败[5]，因此大剂量冲击诱导产生的耐药细胞虽然耐药指数较低，也是模拟临床耐药的良好模型。
3.2耐药细胞的特性
本研究的结果表明：在无药物作用时，SKOV3细胞的集落形成能力强于两种耐药细胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同浓度紫杉醇药物条件下，耐药性最强的SKOV3/TAX30集落形成能力也最强，而敏感细胞SKOV3的集落形成能力最弱，此结果与MTT法检测的耐药性一致。紫杉醇的作用机制是促进微管蛋白二聚体装配成微管，抑制纺锤体形成，将细胞阻断于G2/M期，细胞的有丝分裂异常或停止，使多核细胞的形成增多[6]。诱导的过程中耐药细胞膨胀、形态不规则、细胞体积的增大可能与细胞群体中多核细胞的增多有关。本研究的生长曲线实验中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增时间分别为28.9、24.0h，与敏感细胞SKOV3的倍增时间20.84h相比有明显延长，显示耐紫杉醇的卵巢癌细胞生长速度减慢。细胞周期的阻滞，除导致一些细胞周期特异性药物失效外，肿瘤细胞处于相对静止状态，易对化疗药物产生耐受。
3.3耐药相关基因的检测
卵巢癌紫杉醇耐药机制的研究中，多药耐药（multidrugresistance，MDR）一直是热点。多药耐药是指对一种药物具有耐药性的同时，也对其他结构和作用机制完全不同的化疗药物产生交叉耐受的一种现象。多药耐药的产生是一个多因素的过程，主要包括：（1）细胞内有效药物浓度的降低；（2）细胞内药物活性的改变；（3）凋亡的抑制；（4）肿瘤细胞微环境改变化疗敏感度。P-gp是多药耐药基因MDR1编码的相对分子质量为17kD的一种跨膜糖蛋白，其功能是使细胞内药物浓度降低，药物的作用减弱或丧失，细胞由此获得耐药性。与大多数其他化疗药物的多药耐药机制相似，紫杉醇作为P-gp的作用底物之一，其耐药机制与MDR1基因扩增导致的P-gP高表达密切相关[7-8]。肺耐药相关蛋白LRP是在多药耐药的肺癌细胞株中发现的与MDR相关的非糖蛋白，相对分子质量为110kD，能阻止药物通过核孔进入细胞核，避免其作用于核内靶点，药物运送到胞质的囊泡中，再通过胞吐作用将药物排出体外，从而发生紫杉类药物耐药[9-10]。凋亡抑制基因也参于紫杉醇耐药。BCL2L1基因，全称为BCL-2样1基因（BCL-2-like1）,编码蛋白属于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通过抑制肿瘤细胞凋亡，导致耐药性[11-12]。PRKCA基因为蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被称为PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。细胞过度增殖和抗细胞凋亡机制障碍都可导致肿瘤进展和耐药现象发生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，当其表达增加或活性增强时，可使大量的P-gp磷酸化而活化，从而产生耐药性。本研究结果提示。SKOV3/TAX300细胞PRKCA、LRP的表达均略高于敏感细胞。但SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义。BCL2L1在SKOV3/TAX30细胞的表达低于敏感细胞，但SKOV3/TAX300细胞中BCL2L1的表达略高于敏感细胞，结果提示不同方式诱导的耐药细胞，可能存在不同的耐药机制。
3.4耐药细胞的保存
关键词 动物细胞工程 教学 兴趣教学
中图分类号：G424 文献标识码：A
Interesting Teaching of Animal Cell Engineering
XU Yipeng
（Zhejiang Biometric Quarantine and Inspection and Technology Laboratory，
College of Life Sciences， China Jiliang University， Hangzhou， Zhejiang 310018）
Abstract Based on the development of modern cell biology and technology of an emerging discipline， animal cell engineering is a course that closely integrate theory and practice and that plays an important role in the curriculum of life sciences in institutions of higher learning. This article discusses how to improve the students' interest in the animal cell engineering course， in order to provide a reference for the teaching reform of the animal cell engineering course.
Key words animal cell engineering； teaching； interesting teaching
细胞工程是指按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得具有目的性状的细胞、组织、器官或者个体的综合性生物工程，是理论与实践相结合的典范，在现代生命科学的研究中，细胞工程是生物技术应用于产业一个技术公用平台，代表着现代生物工程最新的发展前沿，在医药、食品、农林等各领域发挥着越来越重要的作用，在高校生命学科及相关学科的课程设置中占有重要地位。动物细胞工程是细胞工程的重要组成部分，主要内容包括：细胞培养、细胞融合与单克隆抗体、胚胎工程、干细胞与组织工程、核移植技术与动物克隆、转基因动物与动物生物反应器和动物染色体工程等。通过学习动物细胞工程这门课程可以为学生今后从事与细胞工程有关的生物技术产业工作奠定良好的理论和技术基础。通过近两年的教学实践和改革，笔者就如何应用兴趣教学法提高学生学习效率和教学质量进行探讨。
1 合理定位课程，让学生充分认识到本课程的重要性
我校动物细胞工程这门课程是在第6个学期开设，学生已经完成对生物学导论、动物生物学、分子生物学、细胞生物学等必修课程的学习，这非常有利于学生对动物细胞工程课程中一些知识进行认知结构的迁移。而动物细胞工程在本校既然是选修课程，其教学目的也必然有别于必修课程。因此，教学目的的侧重点不再是让学生掌握一般的概念和原理，而是更多地让学生领悟和学会如何利用所学知识进行创造，让学生充分认识到动物细胞工程并非一门理论性学习为主的课程，而是一门理论和实践结合非常强的课程，是一门学好可以走向工作岗位的课程。笔者认为，在教授此课程时，需紧紧围绕细胞水平的技术创新和技术应用为中心，联系现代生物技术产业，使学生了解动物细胞工程各主要技术领域的原理和方法及其应用。
2 上好第一节课，吸引学生眼球
上好第一节课，也就为本课程的整个教学过程定下了基调。第一节课的内容无非是绪论部分，大多老师可能会对本课程的发展、地位等娓娓道来，但是却不能引起学生的兴趣，笔者尝试提问式教学代替讲述式教学收到了良好的效果。比如在讲述动物细胞工程的研究领域时，笔者就在教学PPT中列出“多莉”羊、 “人耳鼠”、“试管婴儿”、发光猫等图片尝试让学生对位入座，以激起学生的兴趣。
3 紧跟时代步伐，更新教学内容
目前细胞工程相关的教材有安利国版《细胞工程》（科学出版社）、杨吉成版《细胞工程》（化学工业出版社）、李志勇版《细胞工程》（高等教育出版社）、庞俊兰版《细胞工程》、叙永华版《动物细胞工程》等，笔者所用的参考教材是安利国版《细胞工程》。虽然相关教材众多，但生物技术发展日新月异，教材的更新速度根本无法赶上，因此，必须及时查阅相关文献或信息，传授学生最新的知识。比如讲解胚胎工程可引入人类早期胚胎的成功培养；讲到转基因动物可引入中南大学的“供体猪”；讲到干细胞可以引入“人工肾”等。
4 以社会问题或社会需求为切入点传授理论知识
单纯理论的讲课效果，或者先理论讲解再到实际应用讲解的效果其实并不如从实际需求到理论讲解的效果好，因此笔者在讲解每个章节时尽量先引入社会问题或社会需求再来讲解理论知识，这样一来，学生课上的专注度明显提高，收到的讲课效果也非常好！比如在讲解细胞融合与单克隆抗体这章时，笔者就抛出杭州下沙企业期望与浙江高校合作解决的一些项目，其中就有不少抗体制备技术，这即刻引起学生的关注；比如在讲解干细胞这章节时，引入 “儿子严重烧伤 父亲拒用麻药割皮救子”的新闻事件，让学生重视干细胞研究的重要性；在讲解胚胎工程时，引入广州“代孕事件”。
5 合理利用多媒体技术
动物细胞工程是一门综合性很高的课程，传统的“粉笔+板书（或PPT）”的方式已经难以满足新形势下对这门课程教学的要求。现代教育技术在高等院校中已得到普及应用，通过多媒体技术，我们可以给学生展示除课本外更多的图片和视频信息，甚至可以直接在上课时在网上搜索相关信息给学生看。这些多媒体技术的应用在提高学生学习兴趣的同时，可以发散学生思维，不但可以补充书本内容，也可以提高学生对书本内容的学习效果。比如在讲解实验室的安全性时，可引入电影《生化危机》片段；在讲解细胞融合时，可引入《杂交》这部电影；在讲解胚胎工程时，可辅以3D动画演示婴儿从受孕到诞生全过程；讲干细胞可引入“八戒的肝救活孙猴子”的新闻。每次课讲授时适当适量适时地引入一些多媒体图片、视频或动画信息，可以在上课之初即刻吊起学生对即将要学的知识的胃口，也可以在课中学生注意力不集中时再次把他们的注意力拉回来，多媒体图片或视频可以说是调动学生学习兴趣的一把利剑。但是这把利剑不能过度应用，否则就主次不分，学生把握不住重点，效果就会适得其反。
6 在讨论中实践实验
笔者所授的动物细胞工程有8个学时实验，实验内容为细胞培养的基本过程，基本为验证性实验，但这并不妨碍学生对知识的学习，这主要在于讨论式学习的引入。实验课之前，笔者在课堂上放映培养基过滤操作视频、细胞原代培养操作视频、小鼠心肌细胞培养操作视频等，让学生思考视频中实验人员的操作规范问题，让学生知道实验操作中的注意事项及其对实验结果的影响。在实验课中，引导学生对比实验前后结果，得出自己的结论，比如在做细胞培养基过滤实验时，教学生用倒置显微镜观察未过滤培养基的受污染情况，判断污染微生物的类型，从而让他们知道正确过滤的重要性以及如何处理受污染的培养基。
关键词：地方本科院校；细胞工程；教学改革；理论教学；实践教学
细胞工程学是应用细胞生物学和分子生物学的原理与方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有目标性状的细胞系或生物体有关的理论和技术的学科。它是一门现代生物科学理论和工程技术相结合的综合性学科。本课程围绕细胞工程的主要原理与基本技术进行现代教学[1]，是实践性和应用性很强的专业课。通过细胞工程的学习，学生在系统掌握本课程的理论、方法和技术等基础知识的基础上，结合最新研究动态，使学生可以全面地了解本课程。地方高校细胞工程实践条件普遍薄弱，教师怎样通过高效的教学方法改进教学质量，以达到教学（包括获得中学教师资格证后从事中学生物教学）、科研和生产开发各方面的要求，是摆在每位任课教师面前的一项艰巨的任务[2]。
一、细胞工程教学现状及存在的问题
重庆三峡学院生物技术专业于2007年开始招生，已经经过5年的专业建设，目前，已经形成了较完善的理论实践教学体系。但毕竟生物技术专业招生较晚，细胞工程相关课程的人才储备不足，还没有形成知识结构完善、人才梯度合理和水平较高的师资队伍，另外，实验条件薄弱，特别是无菌细胞培养与操作室要求严格，运行费用较高，难以建成。为此，在借鉴其他地方本科院校经验的基础上，根据自身特点，构建新的教学大纲，使细胞工程教学步入正轨。
二、细胞工程课程改革的总体构想
1.理论教学改革。
（1）突出重、难点，优化教学内容。在教材的选用上，国内虽然有不少版本的细胞工程的教材，但这些教材有的偏重应用、理论缺乏，有的可读性差，不易理解。因此根据我们多年的教学经验，上海交通大学李志勇先生主编的《细胞工程》系统地介绍了细胞工程的基本原理、方法、技术和最新发展，可以作为地方本科院校的教学参考书。但细胞工程发展很快，一些新的研究进展在教材中并没有体现出来，针对这个情况，一方面我们向学生推荐了一些参考书，另外自行编写了符合教学要求的讲义，下发给学生。同时，由于课时的原因，在教学过程中，不可能做到面面俱到，只能选择性地讲解。这就要求教师将教材中相对笼统、分散以及过时的内容，通过总结归纳、提炼和补充等再加工，应用有效的方法手段突出重点（基本概念和基本原理）和难点（容易混淆的概念和难理解的机制），并进一步结合实验课中的实际操作合理安排教学进度及教学方法[3]。
（2）改革教学方法。激发学生的学习兴趣，发挥学生主体主动性。大学教学往往采用灌输式教学模式（教师讲，学生听，教师写，学生抄）。启发式教学则注重教的目的是学，这样教师就由知识的传输者转变为学习的引导启发者，激发学生学习的主动性，发挥想象力空间。在教学过程中，为了调动学生参与课堂教学的主动性、积极性，我们选择细胞工程的某一章节，尝试让学生体验课堂教学，以培养学生的独立思考能力、查阅文献能力、总结归纳能力及语言表达能力[4]。通过这种教学方式，也为准备从事中学生物教学的本科生提高锻炼的机会，深受大家的欢迎。具体来说，提前三周布置教学内容，要求学生在空余时间利用百度等搜索引擎及CNKI、维普、万方、Elsevier、NCBI等专业检索工具，选择感兴趣的内容检索查阅相关资料。一般选择学生感兴趣、应用性较强、与生产实践联系紧密的内容，比如在学到动物细胞培养章节后，让学生课外查阅动物细胞培养在医药、食品等领域比较成功的案例，将工厂生产过程做成多媒体课件，教师选择几个比较有代表性的课件内容，在下次上课时让学生课堂讲解，然后教师点评，并强调本章节需要掌握的重、难点，可以作为学生部分的平时成绩。
注重师生互动，积极引导学生学习，关注学生情感，建设和谐课堂，拉近学生与教师之间的距离。利用上课前的几分钟时间，对前面的内容特别是上节课的内容提出问题，让学生思考回答，以巩固所学内容和检查学生课后的复习情况，同时又可以衔接本节课的讲授内容，一举两得。在课堂上介绍一些重要人物科学研究的故事、实例和经验教训，积极地引导学生进行科学的思维，培养他们的推理能力；同时鼓励学生运用所学知识来分析一些自然现象，发现和解决问题[5]。
优化多媒体教学。细胞工程是一门应用性和技术性很强的学科。理论教学过程中需要很多图表进行讲解，技术中的很多操作环节，如无菌操作、动植物细胞培养等操作严格规范，但传统的板书教学难以保证教学效果。利用多媒体教学，可以很直观地观察操作过程，提高了学生的感官认识，利于操作技能的掌握，加深理解深奥的理论知识。运用多媒体教学时，还应该留出一段时间进行师生、学生与学生互动，有利于学生更好地消化掌握所学内容，充分调动学生的参与意识。
2.实践教学改革。地方本科院校细胞工程类课程实验条件普遍薄弱，需要整合教学资源，优化教学内容。精选实验教学内容，彰显细胞工程实验课程的重点与难点，注重基础实验操作训练，侧重地方本科院校学生应用能力培养，显现课程特色。考虑到我校细胞工程实验室自身仪器较少，实验室运行成本较高，不能够完成“动物细胞原代培养”、“单克隆抗体制备”、“真核细胞转基因技术和检测技术”等技术复杂、成本高的实验，因此选择动、植物细胞培养技术作为主要的实验内容，有的实验还选用演示的方法进行教学，将实验内容分为四个模块，即基础实验、动物细胞工程、植物细胞工程、综合设计。这样既注重了基础操作，利于学生毕业后工作衔接，又突出了创新。
总之，课程教学是实现本科生教育培养目标的重要手段[6]。在我国，细胞工程课程开设较晚，目前还没有形成系统有效的教学模式，地方本科院校因其特殊性，很多细胞工程师资配备有限，实验条件缺乏，有的学校甚至还不能开设细胞工程实验课程。为此，我们依据生物技术专业学生的培养目标，根据教师在细胞工程理论和实验课程教学中的经验与教训，从教学目标、理论教学和实践教学等方面进行了积极的探索与改革，取得了较好的效果。
参考文献：
[1]梁亦龙，魏进民，张继承.细胞工程教学改革的探索[J].实验室科学，2009，（4）：25-26.
[2]王伟霞，李福后.生物技术专业《细胞工程》课程建设与改革[J].科技创新导报，2008，（9）：245.
[3]吴晓丽.提高《植物生理学》课程教学质量的探索与实践[J].科技信息，2012，（1）：286-287.
[4]王海英，刘玲玲，阎晗.细胞工程教学与大学生创新素质培养初探[J].黑龙江教育学院学报，2010，29（10）：91-93.
[5]周春菊.提高植物生理学教学效果的体会[J].高教论坛，2006，（05）：138-139.
[6]王义，刘思言，孙春玉等.在《植物细胞工程》课程教学中培养学生科研能力的思考与实践[J].中国校外教育（理论），2008，（9）：85-86.
基金项目：重庆市高等教育教学改革研究项目（编号：103157）
细胞衰老是细胞不可逆的失去增殖能力的过程，被认为是机体抑制肿瘤发生的重要屏障[2]。但是也有研究表明衰老细胞可以通过分泌表型促进肿瘤发生。因此，细胞衰老与肿瘤之间的关系还需要进一步的研究。而对细胞衰老发生的分子机理的理解，有助于我们开发新的肿瘤治疗策略。目前已经发现多种基因毒性刺激都能诱发细胞发生早熟性细胞衰老，如端粒缩短、原癌基因激活、辐射损伤、活性氧损伤等，这些刺激都能引发DNA 损伤[3]。
细胞衰老存在于多学科中，属于交叉学科，它自产生就与抽象、深奥的哲学紧密联系、相互促进。
一、细胞衰老学说的研究，离不开哲学思维的发展
哲学的发展来源于人类在探索世界时候的不断反省，通过对生命的意义的思索，促进着自然科学的发展。20世纪60年代，Hayflick和Moorhead 等人[4]在体外培养人正常成纤维细胞时发现：多株体外培养的正常人成纤维细胞，在经历多次细胞分裂之后，并没有无限制的增殖，而是发生了增殖失败现象。当排除了因细胞体外培养和营养需求改变等因素的影响后，他们确定这是细胞固有的一种生理状态。而与此现象相佐证的是：胚胎来源的成纤维细胞的增殖能力要比成体来源的成纤维细胞的增殖能力更强。这种现象使得他们提出了细胞衰老（Cell senescence）的概念，并认为这种细胞增殖失败的现象与器官的老化是相关联的[5]。西方医学的很多发展都源于哲学的进步，他们观察自然和人类生活的变化，产生哲学思辩，从而研究物质存在的机制。西方的哲学发展较快，较为进步，正式哲学的发展促进了其他学科的发展，哲学思维给予了医学正确看待生命与健康的理论指导。医学家在哲学世界观与方法论的指导下，从事基础医学研究，推动着医学进步发，促进了基础医学的进步。
二、细胞衰老学说研究要靠实践的唯物主义哲学思想
细胞衰老机制研究是一门医学基础的研究，归从于细胞生物学研究，必须通过反复的实验进行验证。而细胞衰老对于机体器官的衰老，机体本身的衰老都是其研究的基础，是其理论基础，哲学思想充斥在科学实践与理论思维之中。细胞衰老机制研究是一个基础认识过程，由感性认识到理性认识，从机体自然界的生老病死的现象，使人类产生研究其基本结构单位细胞的想法，对细胞衰老的机制研究，进一步解开人类机体衰老的奥秘，从认识到实践，实践再进一步指导认识，实现科研造福于人类的意义。
三、细胞衰老学说研究依靠哲学思维发挥出社会效应，实现价值
哲学对医学的发展具有世界观的理论指导意义，细胞衰老学说的发展也不例外。列文虎克发明第一台显微镜,初步认识了微生物，人类就开始了细胞学说的研究。从细胞的大体结构，细胞壁、细胞器、细胞核的研究，到微细的细胞结构中细胞各组织结构的功能，细胞内信号的传导、物质的代谢，再到细胞生长、增殖、衰老、凋亡机制的研究，所有这些都离不开哲学的指导需要哲学思维价值观来指导任一学科的发展，同时细胞衰老学说的研究，必然伴随社会价值的体现，人类向往永生，向往肌肤的永生，甚至生命的永生，所以哲学承担起揭示医学科学社会效应的责任，指导细胞衰老的研究来充分发挥出其社会效应，这涉及人的出现，生存、发展等一系列哲学问题。离开了哲学，科学的理论基础就将崩塌。物理学家玻恩曾经说“每个现代科学家，都深刻地意识到自己的工作是同哲学思维错综地交织在一起，要是没有对哲学文献的充分认识，他们的工作会是无效的”[6]。细胞衰老学说的研究不是独立的个体，它是普遍联系的，将之与环境问题，经济问题，社会人文问题、法律问题等等综合研究才能真正实现社会价值，为社会的发展，社会的前进起到应有的作用。
四、细胞衰老学说离不开哲学思维的唯物辩证法
科学研究中的哲学思维是与一般科研思维融入一体，真正的唯物主义哲学并不认为假说是唯心的，需要通过不断地提岀新的假说或假设，然后通过构建科学技术，进不去证明。假说或假设是科学无法存在的基础，是科学向前发展的动力。这就是科学的理性主义态度或方法论。用胡适先生说科学的态度或方法就是“大胆地假设，小心地求证”[7]。假设-验证是医学科学家常常使用的思维方式。细胞衰老学说就是首先通过假设，然后通过实验的不断证实进行的，只有不断的假设，不断的通过基础实验去验证，才能使衰老学说的机制得到很好的验证，才能不断的进步，不断的探究，更好的使用在机体衰老机制的研究。
五、正确认识事物的逻辑方法
上海港联门诊部，上海 200122
[摘要] 中医的“阴阳”是一门哲学术语，是一种方法论。中医能治好病决非偶然，中医治病的科学性，就在于通过中药的“四气五味”、“升降浮沉”、“活血化瘀”来净化人体的血液，让人体的组织细胞浸浴在一个良好的生态环境中，与周边进行物质和能量的交换，吸收营养，排出废物，从而组织细胞逐步地来调整和修复自身的功能及时空代谢，使疾病渐渐消失。中医“阴阳”的核心理论是细胞代谢这一命题成立，那么，中医就具有一个完整的理论体系。
[
关键词 ] 中医理论；阴阳学说；细胞代谢；理论体系
[中图分类号] R226 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）10（c）-0184-03
[作者简介] 戴元涛(1941-)，男,汉族,江苏阜宁,大专,主要从事中医理论研究和临床治疗。
1 中医的理论核心是“阴阳”
阴阳是我国古代的哲学理论，是古人对自然界事物的性质及其变化发展规律的认识。在医学中的阴阳理论，则是一种辩证论治的方法，即阴阳的对立与统一、消长与转化的规律，来说明人与自然界的关系，并概括医学中的一系列问题。如：
1.1 在解剖方面
《灵枢·寿夭刚柔篇》曰：是故内有阴阳，外亦有阴阳，在内者，五脏为阴，六腑为阳；在外者，筋骨为阴，皮肤为阳。
1.2 在生理方面
《素问·空气通天论》曰：阴者藏精而起亟也；阳者卫外而为固也。说明阴代表物质的储藏；阳代表机体能量的活动，能卫外固守阴精的作用。
1.3 在病理方面
《素问·阴阳应象大论》曰：阴胜则阳病，阳胜则阴病，阳胜则热，阴胜则寒等等。
1.4 在诊断方面
《素问·阴阳应象大论》曰：善诊者察色按脉，先别阴阳。
1.5 在治疗方面
泻有余，补不足，以调整平衡阴阳为原则，如《素问?至真要大论》曰：寒者热之，热者寒之，《素问·阴阳应象大论》曰：阳病治阴，阴病治阳等等[1]。
阴阳既是中医的基础理论的重要组成部分，又是指导临床实践的方法和手段。
中医的阴阳是站在宏观的高度把人体归纳为既对立又统一的阴阳两个方面，来涵盖人体的一切生命现象。也就是说，把一个复杂的生命现象的辩证关系简单化，只用阴阳或阴中之阳、阳中之阴变化万千的辩证方法，来涵盖人体运动中的一切生命现象。中医的阴阳理论，这是古人理性经验的长期积累和沉淀的结果，内在包含着丰富的中医基础科学知识。然而我们却没有沿着前人知识的理性指引，进入现代科研大门，而是在门外徘徊，就目前我国中医的现状，仍是墨守成规，依附于传统的由阴阳理论到阴阳理论，而无独立于传统之外的知识层面上进行科学研究。
2 中医理论缺少构成生命体的基本元素
中医理论就是多层面地论述人体生命过程中的动态变化。然而从整体观的哲学层面出发，认为自然界是大周天，人体是小周天，人与天地相参与日月相应，提倡起居有常，因时之序才能保持健康。外感六淫，内伤七情则生病，视人体脏俯组织、四肢百骸通过经络构成一体，治病无论用针，施药都着眼於整体，辩证论治，治病必求其本，调整阴阳，扶正祛邪，提倡以情治情的心理治疗方法等。
鉴于当时的历史条件，中医理论不可能去研究生命实体，即构成生命体的基本元素。所以在中医的“阴阳”、“五脏六腑”、“虚实寒热”等都不能准确地表明人体的解剖结构和生理病理的具体位置和过程，诊断都不是建立在理化基础之上[2]。
总的说来，在细节上是不精确的，有的是笼统的、模糊的，多数只有病人的自我感觉，缺少客观标准，这就是中医理论的不足之处。
随着时间的推移，生命科学的不断发展，十六世纪塞尔维特和十七世纪初哈维的血液循环理论的创立，使生理学在实验基础上变为科学，到十八世纪病理学开始发展，随着显微镜在医学上的应用和细胞学说的建立，十九世纪施莱登和施旺创立了细胞学说。之后德国病理学家维尔肖提出,细胞只有来自细胞的细胞学说的基本内容，为人体生命实体找到了微观结构，从而证实了自然界中所有生物体和人类的机体都是由细胞组成的，细胞是生命体结构和功能的基本单位。近代在生命科学中对细胞的研究，包括细胞的信号转导、细胞的分化和干细胞的研究，细胞的增殖和细胞周期的调控、细胞的衰老和细胞的死亡等[3]。
通过对细胞生物的综合研究，从而对构成生命实体的基本元素的认识，奠定了坚实的基础，为人类对疾病机制的认识和治疗找到了依据。
3 细胞是生命体的基本功能
在地球上除病毒外，所有的生物和人都是由细胞组成的，细胞是生命活动的基本单位。对细胞的概念可以从五个方面去理解：
①细胞是构成生命体的基本单位。
②细胞具有独立完整的代谢体系，是代谢与功能的基本单位。
③细胞是生命体生长与发育的基础。
④细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性。
⑤没有细胞就没有完整的生命。
作为祖国医学，中医本身就是研究人的生命过程，包括生殖、生长、发育、衰老、死亡，还包括生理、病理、诊断、治疗等一系列的生命现象，都不可能离开构成人体生命最小单位—细胞的新陈代谢全过程。中医理论应当接纳这个共识，来拓宽和发展自身的理论。要传承中医，要发扬中医，要推进中医现代化，只有将中医的理论核心，由原来人体的无形事物“阴阳”转移到人体的有形实体—细胞上来。
如果把中医理论在微观上从细胞层面上来加以思考，运用细胞时空代谢学说来破译中医基础理论，及在中医古籍书刊中凡是提到中医“阴阳”核心理论的，就运用近代细胞学的新陈代谢来加以破译，关于这方面，本人已作过尝试，并指导临床。如果这一点成为现实，那么古老的祖国医学核心元素，决不是抽象的、模糊的无形事物，而是有形的、具体的、客观的具有生命的实体—细胞。
4 中医的“阴阳”就是细胞的合成代谢和分解代谢
新陈代谢是生命体自我更新的生命活动，新陈代谢包括同化作用和异化作用两个过程，生命体不断地从外界环境中摄取有用的物质，使其合成转化为机体自身物质的过程，称为同化作用；生命体不断地将体内自生物质进行分解，并把所分解的产物排出体外，同时释放出能量供应机体生命活动的需要。称为异化作用。在物质合成时，即在同化过程中需要吸收能量，在物质分解时，即在异化过程中，则释放出能量，因此在新陈代谢过程中，物质代谢和能量代谢是同时进行的，是同一过程的两个方面[4]。任何物质都蕴藏着一定的能量，所以说物质代谢必然伴随着能量的产生。任何能量的转换也必然伴有物质的合成和分解。同化过程和异化过程是同时进行，它们是相反相成、相互依存和相互转化的两个生理过程[5]。
细胞是生活在细胞外液中，即内环境中。细胞外液主要包括血液、组织液、淋巴液和脑脊液，是细胞直接浸浴的场所。然而细胞新陈代谢所需要的养料，也直接由内环境所供应，细胞的代谢产物又是先排到内环境中，内环境中各项理化因素都保持相对稳定状态，称内环境稳态。内环境稳态是臟腑组织细胞生命体正常代谢活动的条件。是自由生命体的生态家园及生命体的健康保证。
在内环境中，人体最重要的体液是血液，血液作为细胞外液的组成部分，是内环境中最为活跃的一部分。血液是一种流体组织，充盈于密闭的心血管系统中，并在心脏“泵”作用下循环不已，在完整的生命体内，起着运输物质、联系各臟腑组织器管的代谢功能及维持内环境中的理化性质，如碳水化合物、营养物质、渗透压、酸碱度、体温和血细胞等稳态性[6]。如果血液理化性质发生变化，那么臟腑组织细胞的代谢功能也随之产生变化。因此，临床血液检测就成为诊断某些疾病的重要手段和依据。一旦有某种不利因素干扰生命体的正常代谢，就会使内环境血液的理化因素失去稳定状态，导致组织细胞的代谢功能紊乱，轻则将自我修复，保持动态平衡，重则产生疾病，严重时则危及生命。
5 辩证论治的核心是调整人体的内环境
人体的臟腑组织都分别由相同种类的细胞群体的结合，细胞是浸浴在细胞外液中，细胞外液（即内环境中）的理化因素的稳态是生命体细胞的生存条件，是臟腑组织器管新陈代谢的生态家园。由此看来，内环境中理化因素的稳态是不容改变的，它将随时随地保持动态平衡。这种稳态一旦改变，必然影响生命体细胞的生存条件，久而久之，改变细胞的时空代谢，同时也导致臟腑组织器管生理功能的紊乱而引起疾病。在治疗上无论是应用什么方法，只要把内环境中的理化因素由异常转化为正常，保持动态平衡，这样才能达到治疗疾病的目的。
中医治病讲辩证论治，讲寒者热之，热者寒之，讲同病异治，异病同治等。如对待外感发热的病人，运用中医治疗，只要辩证论治准确，方法对头，一般在24 h内发热就会退净[7]。如本人在二十多年前收治一个流行性乙型脑炎的小病员，高热不退后出现痉挛和嗜睡、脑电图异常，当时我只用了白虎汤合荆防败毒散加减变化，处方三剂，半小时服一次，每次30 mL，在24 h内高热退净，一周后脑电图恢复正常。之后，像这种疾病是屡试屡效。经化验，白虎汤合荆防败毒散并没有抑制嗜神经病毒的作用，哪又为什么能治好乙型脑炎呢？原因是，中医用药是以四气（寒热温凉）五味（辛、甘、酸、苦、咸）升浮（发散）降沉（下行通利）活血化瘀来治疗疾病的。通过中药的四气（温热寒凉）来平衡细胞外液的寒热温差。通过中药不同性味的辛、甘、酸、苦、咸注入细胞外液中（即内环境中），从而净化和平衡细胞外液的生态环境，为组织细胞提供物质和能量的交换，达到细胞内容物的稳态，平衡机体的酸碱度。由于乙脑患者高热迟迟不退，是气分热加血分热，所以用白虎汤合荆防败毒散加减变化，用苦寒、甘寒等中药进行疏风清热、凉血、解毒，活血化瘀，而且半小时服药一次，连续进行[8]。这样，细胞外液的温度就渐渐下降，患者的高热也渐渐退净，血液得到净化，生态环境得到改变，病毒也由此失去生存条件，疾病也就治愈。
综上所述，中医开具的处方不外乎五种性味—辛、甘、酸、苦、咸的混合，这五种性味也是人体生命中不可缺少的五种元素。医生在开处方前通过对病人的望、闻、问、切，把不同症候群归纳起来，再以阴阳、表里、虚实、寒热八纲进行辩证论治，根据药物五种性味在脏腑中的归经来处方用药，不论其中药方大小多少，但少则是一种性味，多则是五种性味的混合，不同的处方则体现各种性味的不同侧重，病人服用后，经过消化系统的消化吸收，将五种性味注入人体的血液中，即人体细胞的外液环境中，这样，周边的组织细胞就根据自身的需求从中吸收有益的性味，来营养和修复自己，然后对那些多余或不需要的性味最终由自身的细胞外液周而复始地运转来排出体外，以保持人体内环境溶液处于净化平衡状态。所以中医是能治疗各种疾病的。如对于肿瘤疾病的治疗也同样如此，因为形成肿瘤的概念有两点：①在单位体积中组织细胞的个体细胞体积增大；②在单位体积中组织细胞的细胞个数增多，这样就形成了组织占位，这种占位多伴是组织细胞的时空代谢失调，因为细胞在不同时间、不同空间所合成蛋白质的质量、数量、种类都有所差异，在恶性肿瘤中其氨基酸的排列顺序也会产生变化。对于它的治疗，只有改变组织细胞的时空代谢，把组织细胞的时空代谢由异常代谢转化为正常代谢,才能达到治愈疾病的目的。
中医治病的科学性就在于中药能净化人体的血液，让人体的组织细胞浸浴在一个良好的生态环境中，与周边进行物质和能量的交换，吸收营养，排出废物，从而，组织细胞逐步地来调整和修复自身的功能及时空代谢，使疾病渐渐消失。近十余年来，我就运用这种理论和方法来指导临床，如对甲状腺瘤、小叶增生、子宫肌瘤、肾上腺瘤、肝硬化、肝硬化腹水、肺癌、肝癌、胃癌等进行治疗，有的肿瘤消失、有的腹水退净、有的肝硬化消失、有的糖尿病胰岛被激活、有的取得良好效果，有的能延长生命。对于有的病人细胞的时空代谢不能逆转、组织细胞坏死的则死亡。
我们不妨对上文运用逻辑推理的方法进行一番归纳、就得出中医就具有一个完整的理论体系。①在宏观上中医有阴阳学说的辩证关系；②在微观上有构成人体生命最小单位的生命实体—细胞。然而，细胞的时空代谢，又成为阴阳学说论理关系的基本元素。像这样一个从宏观到微观，从无形到有形，在理论上的完整性和统一性的中医理论体系。
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参考文献]
[1]素问.黄帝内经[M].北京：人民卫生出版社,2009：254.978-7-1171-7045-1.
[2]张仲景.伤寒杂病论[M].北京：人民卫生出版社,2009：254.978-7-1171-7045-1.
[3]王建伟,陈瑶,韩峰，等.高频超声对甲状腺病灶伴蛋壳样钙化的诊断价值[J].中国医学影像技术,2013,29(3):358-361.
[4]贾春华.中医理论思辨录[J].北京中医药大学学报,2010,33(7):441-443.
[5]连冬花.系统科学视域中的中医理论及其创新[J].系统科学学报,2009,17(4):46-49.
[6]董向辉,戴汝为.从系统科学和系统复杂性的角度看中医理论[J].系统仿真学报,2002,14(11):1458-1463，1478.
[7]刘带,李锐锋.论中医理论中的系统整体性思想[J].系统科学学报,2009,17(3):90-93.
目的：观察高糖条件下VEGF mRNA,EPO mRNA和EPOR mRNA在体外培养的Müller细胞中的表达情况。 方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后，制成单细胞悬液，体外培养Müller细胞，RT?PCR测定高糖条件下视网膜Müller细胞 VEGF,EPO和EPOR基因的表达。 结果：成功获得视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）染色阳性。Müller细胞VEGF mRNA，EPO mRNA和EPOR mRNA在高糖条件下表达升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)，但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义，无明显时间依赖性。 结论：Müller细胞在高糖条件下VEGF， EPO，EPOR的表达增加。教师职称
【关键词】 视网膜Müller细胞；血管内皮生长因子；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；新生血管
Abstract AIM:To observe the expressions of vascular endothelial growth factor(VEGF), erythropoietin(EPO), erythropoietin receptor(EPOR) mRNA in different levels of glucose in the retinal Müller cells of mice in vitro. METHODS: Müller cells of new?born mice were cultured with enzyme digestion. Müller cells were separated and purified by blowing and striking method. The expressions of VEGF mRNA, EPO mRNA, and EPOR mRNA were detected by RT?PCR. RESULTS: Retinal Müller cells were cultured successfully, 90% of which were positively stained by glutamine synthetase (GS).The expressions of VEGF mRNA, EPO mRNA and EPOR mRNA in retinal Müller cells were significantly enhanced in the high glucose group which increased obviously(P<0.05), but the difference between 50mmol/L group and the 40mmol/L group did not have statistical significance or time dependence.CONCLUSION: With glucose concentration elevating, VEGF, EPO, EPOR expression of cultured retinal Müller cells increased.
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KEYWORDS: retinal Müller cells; vascular endothelial growth factor; erythropoietin; erythropoietin receptor; neovascularization
0 引言
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,是患者视力丧失的主要原因。视网膜Müller细胞为一种特殊的神经胶质细胞，在病理因素下，参与DR 的发生。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)和促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) 具有血管生成素的活性[1]。已经发现，VEGF主要由视网膜Müller细胞分泌，近来Fu等[2]发现，正常视网膜组织中的EPO主要是由 Müller细胞产生的。而增生性视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)患者的眼玻璃体中的EPO浓度增高，与血清中EPO浓度无关[3]。那么，视网膜Müller细胞中VEGF，EPO和促红细胞生成素受体 (erythropoietin receptor，EPOR)的表达受哪些因素调控呢？是否与细胞周围环境中糖浓度有关呢？同时，还是否与葡萄糖作用时间有关呢？为了证实以上假设，我们采用不同葡萄糖浓度干预鼠视网膜Müller细胞，并且同一糖浓度组干预不同的时间，然后观察Müller细胞VEGF，EPO和EPOR基因表达的变化，从而探讨高糖对视网膜Müller细胞VEGF，EPO和EPOR基因表达的调控作用。
1 材料和方法教师职称
1.1 材料
出生7d的清洁级健康昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。逆转录试剂盒（Promeg公司），Simply P总RNA提取试剂盒（Solarbio公司），兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）（美国Adi公司），高糖型和低糖型DMEM培养液 （美国Hyclone公司），胎牛血清（FBS）（灏洋生物技术公司），PCR试剂盒（大连宝生物有限公司），PCR引物及DNA分子量标准(上海生物工程有限公司)，DAB显色盒 、生物素标记的山羊抗兔IgG 、辣根酶标记的链霉卵蛋白素工作液（北京中衫金桥生物技术有限公司）等。出生7d的昆明小鼠脱颈处死后，无菌条件下迅速摘除眼球，移入超净台，D?Hanks液重复冲洗2次后，将离体眼球置于含DMEM培养液(含200mL/L胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L庆大霉素)沿角膜缘后约1mm剪开，轻轻挤压剥取视网膜。将视网膜剪碎，2.5g/L胰蛋白酶消化10min，含血清培养液终止消化。反复吹打细胞制成细胞悬液，经 200目筛网过滤后，800r/min离心5min后弃上清。DMEM培养液调整细胞浓度为3×108/L，接种于事先包被有明胶的50mL塑料培养瓶内,置入恒温湿热培养箱(37℃，含50mL/L CO2，50mL/L空气 )中培养。3～4d后，首次半定量换液，以后换液2～3次/wk。约10～12d，达80%以上融合，以1∶2方式进行传代。小鼠视网膜细胞悬液接种于细胞培养瓶24h后，可见有细胞贴壁呈不规则圆形，有角。3～5d后贴壁细胞增多，并从边缘长出数个细胞伪足。而后细胞分裂生长， 10～12d左右融合达80%以上时，细胞形态典型：胞体呈长梭形，胞质丰富，胞核位于胞体中央、椭圆形、有2个或2个以上核仁，细胞呈轴向平行而紧密排列，可进行消化传代培养。P1～P4代细胞5～7d左右融合达80%以上，与原代细胞具有相似的细胞形态，胞体较原代细胞变大，变长，呈梭形、星形等多种形态。细胞间可有嵌合、粘连。取第2～3代细胞消化接种于预置有盖玻片的六孔培养板内，待盖玻片上细胞增殖到80%融合时，以谷氨酰胺合酶(GS)为一抗，进行免疫细胞化学染色,阴性对照用PBS代替一抗，DAB显色剂显色，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并照相。免疫细胞化学染色示细胞质中和细胞膜上出现棕黄色、棕褐色颗粒状或者网状物质的为阳性细胞。阳性细胞率>90%，可以认为实验所用为 Müller细胞。而加PBS代替一抗的细胞，免疫细胞化学染色呈阴性。
1.2 方法 教师职称
以P3代对数生长期的小鼠视网膜Müller细胞用于实验：将P2代Müller细胞种植于六孔板中，种植前用含200mL/L胎牛血清的 DMEM培养液制成细胞悬液并计数调整细胞浓度约为3×108个/L，接种至六孔培养板中，每个孔1mL，置于恒温湿热培养箱中培养。当孔中细胞达到 80%融合时，换无血清培养液培育24h。分为对照组(糖浓度为25mmol/L)和高糖组(糖浓度分别为30，40和50mmol/L)，培养1，3和 5d。干预过程中每天换液，维持恒定干预浓度。每孔做3个。用Simply P总RNA提取试剂盒（Solarbio公司），提取细胞的总RNA，取RNA 5μL以15g/L琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性，在紫外灯下见到明显的5S，18S，28S的条带认为合格；RNA 2μL用紫外分光光度计测A260nm和A280nm计算A值和浓度，两者比值在1.8～2.0之间者视为合格，剩余于?70℃保存。小鼠引物序列采用Primer 5.0引物设计软件设计，所有碱基对均经BLAST程序检验。所有引物系列均由上海生工生物工程公司合成。EPO引物序列：上游5?CTC TGG GCC TCC CAG TC 3?、下游：5?TGT TCG GAG TGG AGC AG 3?，PCR产物大小410bp。EPOR引物序列：上游5?ATT GGA TAA GTG GTT GCT GCC 3?、下游：5?CCC CCG AAC TGT AAT CTG TTG 3?，PCR产物大小305bp。VEGF引物序列：上游：5?GGA TCC ATG AAC TTT CTG CT 3?、下游：5?GAA TCC ACC GCC TCG GCT TGT C 3?， PCR产物大小450bp。β?actin引物序列：上游：5?GTG GGC CGC TCT AGG CAC CA 3?、下游：5?CGG TTG GCC TTA GGG TTC AGG GGG 3?, PCR产物大小245bp。按照Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit说明进行，总反应体系为20μL，反应前将RNA终浓度调整为0.1g/L，进行逆转录反应。各取cDNA 2μL，分别加入VEGF，EPO和EPOR特异性引物，引物终浓度调整为20μmol/L；内参照β?actin特异性引物终浓度调整10μmol /L。按Taq酶说明书加入试剂，PCR扩增条件：94℃，30s，变性；VEGF 60℃，1min，退火，EPO 59℃，1min，退火，EPOR 58℃，1min，退火；68℃，2min，延伸。以上3步循环35次，最后72℃，终末延伸10min。扩增反应结束后取PCR产物5μL与 Loading Buffer1μL混合，进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳，100V，30min后，自动凝胶成像仪成像分析，计算目的基因mRNA的相对含量。mRNA 的相对含量=目的基因mRNA A值/β?actin mRNA A值。应用MBI公司100bp梯度maker为分子大小对照确定电泳条带。
统计学分析：实验数据用SPSS 17.0软件处理，结果用均数±标准差(±s)表示VEGF，EPO和EPOR的表达组间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 VEGF mRNA的表达 教师职称
Müller细胞VEGF mRNA的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(P<0.05)，但葡萄糖浓度50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。随着干预时间的延长Müller细胞表达VEGF mRNA的表达差异无统计学意义(图1，表1)。表1Müller细胞VEGF,EPO,EPOR mRNA的表达(略)
2.2 EPO mRNA的表达
视网膜Müller细胞EPO mRNA的表达基本上呈浓度依赖性 (P<0.05)，但至最高浓度时(即培养液葡萄糖浓度50mmol/L)差异无统计学意义。在相同糖浓度作用条件下EPO mRNA表达的差异无统计学意义(图1和表1)。
2.3 EPOR mRNA的表达
Müller细胞EPOR mRNA的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(P<0.05)，50mmol/L浓度组相较40mmol/L浓度组差异无统计学意义；相同糖浓度条件下EPOR mRNA的表达随时间的变化，差异无统计学意义(图1和表1)。
3 讨论
视网膜Müller细胞是一种特化的视网膜神经胶质细胞，具有维持视网膜正常结构与功能、营养视网膜等多种生理功能。DR血管闭塞区域Müller细胞胶质反应性增强，细胞轴突长入闭塞的毛细血管内腔，可能参与PVR和 PDR相关的牵拉性视网膜脱离[4]。Müller细胞对胶质细胞酸性蛋白、波纹蛋白、谷氨酸胺合酶（GS）、S抗原、碳酸酐酶等染色阳性，因只有GS在视网膜中仅存在于Müller细胞，所以GS为Müller细胞的特异性标志物[5]。体外培养时25～30mmol/L的高糖浓度，可近似地等同于糖尿病时体内高糖状态，故以此为对照组。我们实验选用30，40和50mmol/L的葡萄糖浓度模拟体内的绝对高糖环境。实验中采用了高糖DMEM培养液，取 25mmol/L葡萄糖浓度作为对照组。VEGF是由2条相同多肽链组成的高度糖基化碱性蛋白。免疫组化研究表明，糖尿病患者视网膜血管内皮细胞VEGF 反应明显增高，而非糖尿病患者视网膜毛细管内皮细胞及周细胞染色较弱[6]。高糖作为DR的始动因素，其可能机制之一为诱导视网膜Müller细胞 VEGF的表达，并且已经出现了针对VEGF血管生成素活性的治疗手段。Avastin是重组的人类单克隆IgG1抗体，与VEGF异构体结合，达到中和配体的作用，从而抑制其生物活性。在PDR手术前1～2wk玻璃体腔注射1～1.25mg的Avastin可以有效地减少术中出血，并且使新生血管消退[7]。我们发现，不同浓度葡萄糖组的Müller细胞VEGF表达较前一浓度升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，这与以往的报道是一致的。而50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。这种现象可能是Müller细胞的一种自分泌反馈调节机制。而随着干预时间的延长，Müller细胞VEGF的表达差异无统计学意义。教师职称
EPO是含有165个氨基酸，分子质量为34.4kDa的激素糖蛋白，EPOR属于Ⅰ型细胞因子受体家族成员之一，由507个氨基酸组成。研究表明在增生性糖尿病视网膜病(PDR)患者的眼玻璃体中的EPO浓度较普通人有显著的提高[8]。高氧诱导的血管增生性视网膜病变的动物模型实验，玻璃体内注射促红细胞生成素受体抗体（EPORA），发现突破视网膜内界膜进入玻璃体腔内的新生血管内皮细胞核明显少于未经注射眼，且新生血管的密度明显轻于未注射眼[9]。EPO/EPOR系统与糖尿病视网膜病变的联系可以具体到DR的不同阶段。早期糖尿病大鼠的视网膜中EPOR呈大量强阳性表达，到了DM的晚期EPO便作为一个血管源性因子发挥作用[10]，由此推测在早期DR中EPO/EPOR是自我保护系统，到了晚期EPO的自我保护转化成了致病因素。我们的实验中发现：不同浓度葡萄糖组的Müller细胞EPO mRNA，EPOR mRNA表达较前一浓度组明显升高 (P<0.05)。而50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。同样可能为Müller细胞的自分泌反馈调节。随着干预时间的延长，Müller细胞EPO/EPOR的表达差异无统计学意义。故高糖条件下视网膜Müller细胞的EPO/EPOR表达增多可能为DR发生的机制之一。因此，我们推测DM可能通过刺激视网膜Müller细胞VEFG,EPO,EPOR的分泌增多，从而导致 DR的发生。
【参考文献】
1 俞梅，郎景和，朱兰，等.子宫颈病变中促红细胞生成素受体的表达及其与微血管密度的相关性研究.中国现代实用医学杂志2005；14（6）：1?4
2 Fu QL, Wu WT, Wang H, et al. Upregulated endogenous erythropoietin/ erythropoietin receptor system and exogenous erythropoietin rescue retinal ganglion cells after chronic ocular hypertension. Cell Mol Neurobiol 2008；28(2):317?329
3 Katsura Y, Okano T, Matsuno K, et al. Erythropoietin is highly elevated in vitreous fluid of patients with proliferative diabetic retinopathy. Diabete Care 2005；28（9）：2252?2254
4 凌志红,徐格致.糖尿病视网膜Müller细胞病理改变的体内外研究.眼科研究 2005；23 (3): 262?265
5 苟琳, 张作明, 徐汉鹏. 视网膜Müller细胞在视网膜病变中的作用和研究现状.眼科研究2003；21（2）：217?220
教师职称
6 Yokoi M, Yamagishi SI, Takeuchi M, et al. Elevation of AGE and vasular endothelial growth factor with decreased total antioxidant status in the vitreous fluid of diabetic patients with retinopathy. Br J Ophthalmol 2005；89(6): 673?675
7 李灵,席新华.Avastin在眼科中的应用.国际眼科杂志2008；8(3):582?583
8 Lynch SS, Cheng CM. Bevacizumab for neovascular ocular diseases. Ann Pharmac 2007；41(4): 614?625
医学细胞生物学是在显微、亚显微和分子水平三个层次上，研究细胞的结构、功能和各种生命规律的一门科学。有机体的一切病理现象都是细胞病理反应的结果，所以一切生命现象都可从细胞中得到解答。我校医学细胞生物学课程在这些年的教学实践基础上形成了具有自己特色的内容体系结构。其核心部分包括:细胞概述、细胞质膜与跨膜运输、内膜系统与蛋白质分选、细胞骨架与细胞运动、细胞周期调控、细胞凋亡与衰老。从1996年开始，我校主要依靠教师出去进修，引进多媒体课件，并逐步在临床医学专业课堂上使用，并于1999年医学细胞生物学教学全过程使用。在此基础上，2000年增设蒙药学专业、2007年设护理专业、2008年设检验专业，全校各专业的医学细胞生物学均由我教研室承担，面对不同专业不同学生群体所讲受医学细胞生物学知识内容不同，因此，我校多媒体课件急需进行系统的制作。
二、医学细胞生物学多媒体课件制作方案
制作符合我校民族特色资源的多媒体课件，使学生既能扎实掌握细胞生物学的基础知识和基本理论，又具有较强应用知识的能力和探究创新意识，为后续的生物学课程的学习和高素质的生物科学人才培养奠定坚实基础。首先，我们需要整理教研室每一位老师多年教学积累的医学细胞生物学教学课件，按不同专业、不同学时、不同民族班级分门别类进行课件制作。
1．针对不同专业。
我校开设细胞生物学的专业有临床专业、护理专业、检验专业、影像专业、蒙医专业以及蒙药专业。临床等专业开设本课程的目的是在现代水平上讲授关于细胞结构和功能的基本理论，并且对由于结构损伤和功能失调而引起的疾病做适当的联系，以便为学习专业课打下必要的细胞生物学基础。蒙医、蒙药作为民族特色专业开设医学生物学，其中1/2讲授细胞生物学知识，1/2讲授遗传学知识。那么，对于这两个专业的细胞生物学课件制作时，我们可结合蒙医蒙药，例如利用区域特色蒙古族传统药用动植物，以其细胞结构、功能特点，讲解医学细胞结构与功能这部分内容。这种利用熟悉常见的样本作为实例，学生更易接受。将蒙医治疗原理联系细胞病理反应，讲授细胞质膜与跨膜运输、内膜系统与蛋白质分选，联系专业实践，使学生更乐于学习。
2．针对不同学时。
由于每门课程都有一定学时，如蒙医蒙药学时为12学时，临床等专业24学时，教师不可能把所有内容都做成课件，这就涉及内容取舍问题。蒙医蒙药课件制作中我们将体现细胞生物学核心内容:细胞质膜与跨膜运输、内膜系统与蛋白质分选、细胞骨架与细胞运动、细胞周期调控、细胞凋亡与衰老。临床、护理、检验专业课时24学时，那么我们将适当增加细胞生物学知识，即细胞信号转导、细胞外基质及细胞连接。
3．针对不同学生群体。
关键词：高中；生物；细胞器教学；知识点分类
中图分类号：G633.91 文献标志码：A 文章编号：1008-3561（2015）30-0029-01
细胞器是真核生物细胞结构和功能上的重要组成部分，是细胞独立进行生命活动的基础。高中生物教学中，细胞器相关知识和教学活动，就成为“细胞类型和结构”这一章教学活动的重点，对高中生物教材后续章节的学习也有较大的影响。细胞内的细胞器种类很多，比较常见的细胞器有：线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、溶酶体、核糖体、液泡和中心体等。这些细胞器在不同的细胞内种类和数目也有所不同，同一种细胞器的功能也会发生变化。学生不仅仅要熟悉各种细胞器的结构特点、物质组成和功能，还要熟知这些细胞器在生物界的分布以及部分特殊的细胞器在动物细胞和植物细胞中功能上的区别。针对上述困难，借鉴其他教师的先进经验，结合自身情况，采取分类教学，将细胞器分为双层膜细胞器、单层膜细胞器和无膜细胞器，再指导学生以小组为单位进行分类学习，总结不同细胞器的分布、结构特点、组成物质和功能特点。
一、双层膜细胞器
双层膜细胞器有两种：线粒体和叶绿体。二者虽然都是双层膜细胞器，但是形态、化学组成和功能有很大的区别。在讲新课之前，先将学生通过自主学习完成的重点学习内容通过PPT呈现给他们：线粒体和叶绿体的共同点；线粒体和叶绿体的各自特点：从分布、形态、结构（扩大反应面积）、组成成分、功能等方面阐述。学生在教师指导下完成自主学习，并且按照分组讨论完成导学案上的基础知识梳理；同时教师巡视各学习小组，更进一步地掌握各小组的学情，了解学生对线粒体和叶绿体知识的掌握情况，为下一阶段的讲解作准备。学生完成自主学习后，我习惯先检查学生的学习成果，采取小组竞赛等形式促进学生进行自主学习成果展示。但是学生总结不能代替教师的讲解，教师还应在学生总结的基础之上进一步对知识点进行总结和提取。
二、单层膜细胞器
在高中教材中，细胞里的单层膜细胞器有四种，分别是内质网、高尔基体、液泡和溶酶体。由于内容相对上部分较为简单，我直接在投影仪上投出表格，让学生按照表格的内容要求，自主完成基础知识的学习和较难问题的总结。（1）内质网。很多学生对内质网的功能会产生混淆，认为粗面内质网是合成蛋白质的场所。这时候，教师就应该明确指出，粗面内质网并不是单一的细胞器，而是由于核糖体附着在内质网上而形成的，实质是核糖体和内质网结合后形成的特殊结构。在粗面内质网上的核糖体合成蛋白质，内质网的任务就是蛋白质的加工和运输。高中生物考试中关于粗面内质网的考查较多，具体例题我们将会在后面的核糖体部分进行讨论。（2）高尔基体。高尔基体的形态和功能相对于内质网要简单，但是教师要指明高尔基体有其独特之处――在动植物细胞内的功能不一样。动物细胞中，高尔基体负责蛋白质的加工和分泌；植物细胞中，高尔基体只负责细胞壁的形成。（3）溶酶体。只需要在学生完成自习之后简单地向学生介绍：溶酶体是从高尔基体上脱落的部分，内部含有水解酶，和细胞的程序性死亡有关。（4）液泡。液泡是植物标志性的细胞器之一，在高中生物教学中，液泡可以作为判断是否是植物细胞的依据。教师也要让学生明白：只有在成熟的植物细胞内才有明显的中央液泡。液泡在植物细胞中是比较重要的细胞器，对维持细胞渗透势和促进植物细胞吸水有重要意义。此外，还有可能会结合中心体考查学生对细胞类型的判断，这部分实例将结合中心体部分进行探讨。
三、无膜细胞器
在高中生物中，涉及的无膜细胞器只有核糖体和中心体。（1）核糖体是学生接触到的第一个细胞器，也是唯一一种存在于所有细胞内的细胞器。但是在真核生中，核糖体和内质网会组合成为粗面内质网，在这个时候学生就会对核糖体和内质网的功能产生混淆。例如，当粗面内质网上的核糖体大量脱落，会造成什么影响？遇到这种复合式的问题，就需要学生较为全面细致地掌握游离核糖体、附着核糖体和粗面内质网的相关知识点。经过精确的讲解，学生很轻松就可以搞清楚，由于核糖体是蛋白质组装车间，所以粗面内质网的核糖体大量脱落会导致分泌蛋白的合成受到影响。（2）中心体是一个比较特殊的细胞器，分布于动物和低等植物细胞内，这一点容易让学生在学习时出现知识点的混淆。线粒体的结构和形态比较特殊，易于识记，也便于在识图题中辨认出来。动物细胞内的中心体和动物细胞的有丝分裂有关。所以，对中心体的考查也就集中体现在其结构、分布细胞的考查和动物细胞有丝分裂中星射线形成等方面。相对于其他细胞器，中心体的考查点以记忆和应用为主。例如，在一张细胞显微结构图中，同时出现细胞壁、液泡和中心体，很多学生在判断该细胞属于动物细胞还是植物细胞时会出现争议。我认为，学生对刚刚学习的知识点掌握不够深刻，因此才出现争论，这样的争论可以让师生及时发现教学过程中出现的理解偏差，及时指出和纠正，让学生最终形成正确的知识体系。
四、结束语
细胞器这一部分的教学任务相对繁重，知识点较多，学生学习起来有很大的困难。因此，教师应该灵活多变地针对学生的记忆和理解能力，在上课前反复钻研教材，和其他老师一起打磨课程，尽可能地采取适合学生的教材加工策略，从而促进学生的主动学习。
参考文献：
论文关键词：肿瘤细胞，RASSF1基因家族，转录，RAS家族
近年来较多研究都发现染色体3P21.3等位缺失在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌等常见肿瘤中频繁发生，推测该位点可能存在一个或多个肿瘤抑制基因。2000年，Dammnn等 [1]利用酵母双杂交筛选的方法从3P21.3内120 kb长最小纯合缺失区分离出一种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因，由于其核苷酸序列的碳端(C-terminus)与小鼠RAS相关区域家族1（RAS association domainfamily 1）与小鼠RAS效应蛋白Nore1高度同源，遂命名为RAS相关区域家族1，即RASSF1基因。由于选择性剪切和不同启动子的使用，RASSF1基因至少存在7个不同的转录本（转录本A-G）。有研究发现RASSF1能直接参与细胞周期的调控医学论文，在体内和体外能抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡[2]。
最新研究进展揭示，抑癌基因功能的抑制或失活，除了与基因段的丢失，DNA核苷酸序列的错位、缺失、重组、变换、点突变等机制相关外，还与抑癌基因DNA核苷酸序列中的胞嘧啶核苷酸（C）和鸟嘌呤核苷酸（G）二联连结中（CpG）的胞嘧啶碱基环中的第5位碳原子上所发生的甲基化具有极其重要的相关性[4]。抑癌基因R ASSF1的表达作用机制已经初步明确,但其转录本基因在恶性肿瘤中的作用研究较少，尤其是RASSF1B,RASSFIF在肿瘤细胞中的表达比较还未见相关报道。本文旨在通过RT-PCR的方法，检测五种常见的肿瘤细胞中RASSF1家族中RASSF1B,RASSF1F不同转录本的表达情况，为基因治疗提供理论基础。
1 试验材料与方法
1.1 试验材料
5株肿瘤细胞AGS（胃腺癌）、95D（高转移肺癌）、LTEP-a-2（肺腺癌）、HEPG2(肝癌)和U937（白血病细胞）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；MMLV反转录试剂盒购于Promega公司。
1.2细胞培养
试验所选用的五种肿瘤细胞用DMEM(Invitrogen)加10 %小牛血清，CO2培养箱中37 ℃恒温培养至细胞均匀覆盖细胞瓶约3/4。
1.3cDNA的制备
以Trizol提取的方法提取细胞总RNA并纯化, 用MMLV反转录得到五种肿瘤细胞的cDNA。
1.4 RT-PCR
利用DNAstar软件设计RASSF1家族两种转录本的特异引物，以人β－actin为内参，通过RT-PCR方法检测这两种转录本在五种肿瘤细胞中的表达情况论文的格式。引物序列见表1。反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s 医学论文，72 ℃ 1.5 min 30个循环，72 ℃ 10 min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 应用生物信息学软件分析7种转录本的剪切方式。
2 结果
2.1 两种转录本的读码框结构的比较
表1 扩增RASSF1的两种转录本的引物设计
基因
异构体
GenBank
登录号
引物 Forward （F）/
Reverse （R）
读码框长度（bp）
扩增片段长度（bp）
B
NM_170712
F：atgagcttgaacaaggacgg
570
591
R：tccacctgggggtacaagagg
F
NM_170716
F：atgtcgggggagcctgagct
279
281
R：ggtcaggtgtctcccactccac
actin
AK225414
F：gagaccttcaacaccccagcc
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