摘要：在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
关键词： 植物
论文关键词:植物组织培养褐变酚类物质多酚氧化酶醌类物质
论文摘要:植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃话现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了全面分析，褐变的影响因素是复杂的，随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同，对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。
在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。
1褐变原因及危害
褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。
2褐变产生的机理
2.1非酶促褐变
非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。
2.2酶促褐变
目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。
在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。
3褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。
3.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。
3.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。
3.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。
3.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。
4防止外植体产生褐变的对策
从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。
4.1适当外植体的选择
取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。
4.2对外植体的处理
通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。
4.3适宜的培养基
培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。
4.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。
4.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。
4.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
4.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。
4.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。
4.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。
4.4添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。
4.5进行细胞筛选和多次转移
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
论文关键词:植物组织培养褐变酚类物质多酚氧化酶醌类物质
论文摘要:植物组织培养过程中，褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃话现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题，本文结合相关资料，对影响褐变的因素作了全面分析，褐变的影响因素是复杂的，随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同，对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。
在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。
1褐变原因及危害
褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。
2褐变产生的机理
2.1非酶促褐变
非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。
2.2酶促褐变
目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。
在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。
3褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。
3.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。
3.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。
3.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。
3.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。
4防止外植体产生褐变的对策
从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。
4.1适当外植体的选择
取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。
4.2对外植体的处理
通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。
4.3适宜的培养基
培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。
4.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。
4.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA+0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA+1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。
4.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
4.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。
4.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。
4.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。
4.4添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2+结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。
4.5进行细胞筛选和多次转移
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
【摘 要】林木育种是推动林业产业可持续发展的基础性工作。近年来，针对国内水土流失、土地沙漠化等生态问题，国家加大了对林业发展的重视程度，各级政府和林业部门也积极响应国家“绿色发展”理念，扩大林木种植面积。在这种情况下，林业发展对优质树种的需求量不断上升，而传统的树种培养周期较长，短时间内难以满足地区林业发展需要，植物组织培养技术具有繁殖速度快、苗木质量高的优点，在现代林木育种中受到了广泛的应用。
【关键词】植物组织培养 林木育种 品种改良
植物组织培养是利用植物的某一组织或器官，在无菌环境下进行培养，并最终生产成完整植株的无性繁殖方法。随着相关生物技术的不断成熟和发展，植物组织培养已经广泛的应用于植物育种工作中，在推动我国林业产业发展中发挥了重要作用。文章首先分析了组织培养技术在林木育种中的具体应用，随后对其应用意义进行了论述，最后就组织培养技术的应用前景进行了总结展望。
1 组织培养技术在林木育种工作中的具体应用
1.1 实现苗木的快速、优质繁殖
目前，利用植物组织或器官实现繁殖育苗主要有三种形式：一是诱导母本植株上的腋芽发育，生成新的植株；二是诱导植株组织形成新的体胚，然后在利用特殊培养方式，促使体胚发育成新的植株；三是将植物组织诱导生成新的愈伤组织，利用愈伤组织的再分化能力，生成新的植株芽体，实现扩繁目的。三种林木育种方式各有优缺点，因此在开展植物组织培养时，应当结合实际情况，做到有针对性的科学选择。
例如，在一些地理位置相对偏远、交通不便的原始林区，由于人工管理困难，在林木种植上选择松树、柏树林为主。这类树木由于生长环境相对恶劣，因此对树种的质量要求较为严格，以此来提高树种移植后的成活率。在组织培养技术选择上，通常以诱导母本腋芽发育方式为主，确保培养出的树种能够完全继承母本优良形状，在短时间内适应移植后的新环境。而在城镇郊区或是一些交通便利的农村地区，林业发展多以速生林为主，例如杨树、桉树、槐树等。这类林木的优点在于生长速度快、经济价值高，因此对于树种的需求量也相对较大。在选择组织培养方式上，多以诱导愈伤组织培养新植株的方法，来提高单位时间内的树种培养速度。诱导植株组织培养方式主要适用于果树树种繁育，一来是果树生长周期相对较长，对于树种需求量较为缓和，二来是果树对于树种的优良性质要求较高，诱导植株组织的培养方式能够实现“基因优选”功能，确保果树经济价值的实现。
1.2 植物组织、细胞及器官功能分析
植物组织培养所选用的必须是具有完全遗传信息的组织或器官，包括母本植株的茎、叶、胚芽等，虽然这些组织或器官中的遗传信息都是相同的，但是其培养效果也会受培养环境、培养基营养成分等外界因素的影响。根据这一生物特性，可以对植物的组织和器官的形成过程、结构特性进行技术分析。例如，更加大量的植物组织培养实验表明，以植物茎作为组织培养对象，培养过程中植株的细胞膜的通透性更强，对于外界病毒入侵的抵抗力更明显，根据这一实验结论，我们在进行植物组织培养时，可以有针对性的选取母本植物的组织或器官。例如松树虽然具有较高的生态价值和经济价值，但是幼苗期的松树抗病虫能力较低，很容易发生病害侵袭影响，影响松树幼苗的成活率。通过改良植物组织培养技术，能够极大的改善这一影响因素。
1.3 植物组织培养中的灭菌工作
在植物组织培养中，最重要的一点就是要防止组织或器官受到外界细菌、病毒、微生物的干扰。目前，植物组织培养大多数在无菌室内进行，但是这只是从硬件方面确保了工作环境的安全，除此之外，操作人员还应当保持良好的工作习惯，例如要保持操作台干净整洁，刀具、仪器使用前后都要做好消毒处理、佩戴标准消毒作业设备等。
植物组织培养实验室内的灭菌方法主要分为物理法和化学法，其中物理法主要包括加热、蒸煮、射线处理、无菌水清洗等，化学方法主要是利用一些特殊的化学制剂，例如双氧水、高锰酸钾、漂白粉、酒精等。不同的化学药品所针对的细菌种类也不尽相同。但是无论采取何种灭菌措施，都不可能达到完全灭菌的效果。尤其是一些带有芽孢组织的细菌和霉菌，生存力较强，即便是采取消毒措施后也既有可能存活下来，一旦遇到富含营养物质的培养基，这些细菌和霉菌就会大量繁殖。因此，植物组织培养实验室内应当定期做好消毒措施，严格执行消毒标准，真正实现“无菌操作”。
2 植物组织培养技术在林木育种中的意义和展望
由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是“快”，通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量，以一个茎尖或一小块叶片为基数，经组织培养一年内可增殖到10000-100000株。
不可否认的是，现阶段的植物组织培养仍然面临一些技术和操作上的问题，其中主要集中在以下几方面：首先，繁殖效率和繁殖质量之间的矛盾问题日益突出，在近几年植树造林活动的影响下，各地区的林业建设活动规模不断扩大，无形之中增加了植物组织培养的工作压力。部分管理人员盲目追求经济利益，将一些未达到移植条件的植株销售给林业部门，导致树苗成活率低。因此，如何做好植物组织培养速率与市场需求之间的矛盾，成为当前组织培养单位所面临的首要问题。其次，培养过程中不可避免会出现变异植株，也会造成一定的苗木资源浪费。
“绿色发展”理念被纳入“十三五”发展规划中，为林业的可持续发展指明了方向。未来一段时间内，随着林业产业规模的不断扩大，对于树种、苗木的需求量也会逐渐攀升，植物组织培养能够很好的满足当前林木育种的各种需求，具有广阔的发展潜力和应用推广价值。
摘要：对园艺植物组织培养教学体系进行了研究，针对其在教学中存在的问题进行客观分析，通过制订科学合理的教学大纲、优化实验教学内容、建立开放式实验室及改革考核办法，来强化教学效果，全面培养学生的综合技能。
关键词：园艺植物组织培养；教学改革；教学实践
《园艺植物组织培养》是园艺专业的重要专业课程。园艺专业按照“厚基础、宽口径、强能力”的原则，修订了适应学分制要求的专业人才培养方案。园艺植物组织培养这门课程对于培养园艺方面的专业应用型人才具有十分重要的作用。
一、园艺植物组织培养课程在园艺专业中的重要地位
近年来，农业效益化和都市化进程的不断发展使农业科研院所和农业现代化园区的组培项目的数量迅猛增加，同时，新兴的组培企业也越来越多。在这种情况下，有效结合植物组织培养课程和生产实际，缩短毕业生的实际工作能力和社会需求的差距同时提高学生的实践和适应能力就显得尤为重要。因此，通过改革和完善园艺植物培养课程的教学内容、手段和条件，合理构建园艺植物组织培养课程的特色，可以有效将企业实际工作环节融入到教学过程中，从而更好地实现培养园艺专业人才的目标。
二、园艺植物组织培养课程在教学中的存在的问题
1.教材编写难以适应现代教学模式。在编排园艺植物组织培养教材的过程中，相关人员应该通过全面编排学科包含的所有知识点的方式来保证教材内容的完整性和学术性。而在实际教学过程中，如果教材内容太过详细，教师容易产生依赖心理而完全按照教材内容进行生硬的传授灌输，从而减少教学过程中与学生互动的积极性，直接导致学生对教师的教学失去兴趣和信心。这种教学方式与现代教学倡导的以学生为主体的探究式教学方式相矛盾。而这种教学方式所培养出的学生缺乏学习的主动性和创新性。
2.传统教学方式难以实现对学生实践能力的培养。实验教学的传统教学模式基本是以教师为主。通常情况下，教师在上课之前事先准备好所需的实验材料并设置好具体的实验流程。在实验教学课程中学生需要根据教师设置好的实验流程进行具体的实验操作。一般来说，传统的实验方法无法真正发挥效力，因为植物组织培养以实验技术水平为发展的根本，其侧重于实验者实践能力，对操作水平有着极高的要求。植物组织培养在教学实践中要高度重视实践技能，在教学活动中要确保学生的主体地位，鼓励学生自主探究，通过学生自我实践提升植物组织培养技能，进而体现出园艺植物组织培养课程的宗旨。
3.传统教学模式难以实现教育目标。传统园艺植物组织培养的教学目标的定位相对较低，只是简单地要求对知识和技术的一般性认识和了解，缺乏对知识和技术能力的深入性探讨和研究的要求。然而，传统的园艺植物培养的教学方法和教学模式相对来说比较落伍，填鸭式的灌输教学模式也比较陈旧。在这样的教学方法和模式下，学生只能了解到相对空洞的理论性知识，更无法达到现代教育的教学目标。因此，在实际的教学过程中，教师不但要尊重课程本身的发展规律及其特点，还要重视培养学生的实践能力，树立全新的教学观念，积极采用多媒体等新技术手段，激发学生学习的主动性，构建良好的学习氛围，鼓励学生自主学习，培养学生的创新能力，从而有效深化学生对植物组织培养理论知识的认识。
三、提升园艺植物组织培养教学效果的对策
1.合理规划理论教学内容。在信息无比丰富的知识爆炸时代，学生从来不满足于单一知识的学习。当下学生不仅要学习理论知识，更要掌握有效学习的能力，还要学习将理论知识和社会实践有效结合起来。植物组织培养课程不仅对学生提出了扎实掌握课程理论知识的要求，还提出了领会和掌握植物组织培养的实用技术的要求。另外，学生还应对植物组织培养方面世界前沿的高端技术有一定的认识和了解，同时，还要具备将理论知识应用到社会实践生活中的能力。学生在学习过程中所掌握的技术和知识水平存在差异，因此，教师应该因材施教并根据学生的实际情况合理调整教学内容和教学顺序，从而提高教学效率。
2.改革实验教学内容、手段。（1）尊重学生实验活动的主体性。在新的教育教学大纲指导下，实验教学获得了革新，在实验中要充分尊重学生的主体性，提升学生独立动手能力。实验课程以小班制为基础，每班人数控制在25人以内，在实验过程中教师要尽量缩短讲授时间，在对实验目的、要求、方法、注意事项讲解完毕大胆鼓励学生自主实验。学生根据教师对实验的讲解以及自身知识独立实验，在独立探究中自主解决实验中所出现的问题，若出现无法解决的问题应主动向教师提问，面对学生的提问，教师要给予针对性的指导。（2）实施开放实验室制度。传统实验室由教师控制，在教师的控制下，学生在实验室进行实验活动，实验活动的准备以及实验所需材料均有教师主导，学生的实验活动只是对教师实验示范的机械重复，在这种传统实验教学模式下，学生难以准确采集实验材料，不会科学构建实验流程，对实验的反馈也仅仅停留于理论知识，这对于学生自学学习能力的培养和探究学习能力的提升是极为不利的。为了实现现代化实验教学模式，教师可以针对学生进行基础实验训练，然后根据学生的实践能力全面开放实验室。学生在与教师的沟通后可以进行课外实验，教师也可以根据学生的实验能力鼓励学生自主探索实验。
3.现代教学手段和方法的灵活应用。（1）教学方法的灵活运用。园艺植物组织培养是现代生物学重要组成部分，以遗传学、微生物学、植物生理学、植物学等学科为基础，因而在进行教学中，教师可以提出其他学科教学专业的问题为引子，激发学生们的学习积极性，或者以生活中的真实事件为课程导入，让学生对事件给予反馈，提升学生课堂参与度，在师生互动中有利于营造良好的课堂氛围。（2）教学手段的灵活运用。植物组织培养是一门操作性很强的课程。因此，教师应该合理采用直观性较好的教学方法。在实际教学过程中，教师可以将实物直观展现在学生面前，使学生对课程内容有直观形象的了解和认识。比如，教师可以带领学生走进组织培养实验室，在对实物的实地参观过程对教学内容进行详细介绍，从而帮助学生深刻记忆设备名称和特征。再比如，讲解植物离体培养成苗过程等内容相对较为复杂而且耗时较长。对于这种情况，教师可以采用多媒体技术手段辅助教学，将实验整个过程制作成内容丰富的课件，然后，通过多媒体课件的展示，使学生形象地理解教学内容并加深实验过程的理解。（3）深入植物组织培养工厂。园艺植物组织培养技术与社会生活紧密联系。在我国，植物组织培养的工厂已经十分常见，很多工厂都通过植物组织培养在工厂内进行蔬菜、果树和花卉等植物的机械化繁殖。植物的繁殖不再受到传统方式的时间和空间的局限，从而实现了工厂式的周年连续生产。植物组织培养对植物生长控制因子实现了人工调节，在可控制的环境内实现植物快速繁殖，满足社会的需求。同时，引入植物脱病技术，不但可以有效提升植物的质量，还可以提高植物健康繁殖的速度。总体来说，植物组织培养的发展前景十分乐观。
4.考评方式多样化。考评直接反映出学生对《园艺植物组织培养技术》课程的学习成效，如果教师只依据卷面成绩来对学生进行学习效果评价，那么就会让整个考评过程缺失客观性和有效性。因此，教师在对学生进行课程考评的时候，就可以把多种考评方式结合在一起，并从多个方面去对学生的学习情况做出客观的评价，从而让课程的考评能够实现客观性和有效性。比如：教师可以把理论知识考评、实验考评、技能实际应用能力考评这三者合理地结合在一起，并让它们按照一定比例进行分数划分，对学生的学习成果进行全方位的考评。
四、结语
随着我国园艺植物组织培养技术地不断提高和发展，大多数农林院校为了更好地进行园艺植物组织培养的教学都将《园艺植物组织培养》这门课程设置为学生的必修或选修课程。由于园艺植物形态变化相对较大而且种类偏多，园艺植物组织培养教学活动的开展应以园艺植物组织培养技术和理论为先决条件，并根据不同园艺植物的不同特点，从而使学生扎实掌握基础理论知识，并将其与实践操作有效结合。另外，教师在授课过程中要合理把控好授课重点，尤其是对植物组织培养专业特征的明确。
摘要 通过对植物组织培养课程教学方法、教学手段、教学内容及教学评价的实践探索，总结改进，加强实践教学环节，以培养学生的综合技能和创新能力。
关键词 植物组织培养；教学实践；实验教学
植物组织培养是一项近年来迅速发展的生物技术，已渗透到生物学科的各个领域，成为生物学的重要研究技术和手段[1]，并广泛应用于农业、林业、工业和医药业，产生了巨大的经济效益和社会效益，成为当代生物科学中一门较有生命力的学科。植物组织培养是生物技术应用专业和园林技术专业的职业技能模块之一，学生通过该课程的学习，掌握植物组织培养的基础理论、基本知识和基本操作技能，最后达到用植物组织培养技术进行植物脱毒快繁的全过程。目前，多数农林院校都已开设植物组织培养课程[2]。汉中职业技术学院农林系依托优秀的教学团队和植物组织培养良好的市场前景，经过充分考察论证，在2010年成立植物组织培养实验室，并于2010―2011学年在生物技术及应用、园林技术及应用2个专业2个年级3个班开设此课程，经过1年的课程教学，取得良好的教学效果和社会评价，现就教学过程进行探讨。
植物组织培养技术是一门实践性较强的课程，实验课是该课程教学中的重要环节。为保证学生熟练掌握组织培养技术，学院把课程的重点放在培养学生的实际动手能力上。为了保证学生在掌握组织培养的理论基础的同时，加强其实践操作能力的培养，学院在教学中进行了一些改革尝试。
1 改验证性实验为探索性实验，培养学生的思维能力和认识能力
传统的实验多为验证性实验，即学生在实验课上对课本中的实验结论进行验证，这虽然能使学生加深对理论的理解，但不利于其思维能力、认识能力的培养和提高，特别是对于学情复杂的高职学生。因此，根据该课程的特点，学生在教师指导下，进行探索性实验，效果会更好。如所用培养基配方不同，植物生长效果也各异。教师在教学中并不是直接将这些实验方法告诉学生，而是指导学生根据所学的理论知识进行探索性实验，最后通过实验和分析，得出最佳的方案或结果，使学生认识到接种外植体、材料大小、取材季节、灭菌方法等均对实验结果有较大影响。这样不仅加深了学生对理论知识的理解，培养了学生的思维能力和观察能力，提高了实验效果，还提高了学生的动手能力。
2 运用多种教学资源，改进教学方法，变单一教学方法为多种教学方法综合运用
汉中职业技术学院在实验实训室安装了投影教学设备，教师可在实验室对学生进行该门课程的讲授，课程教学结合现代多媒体教学手段，采用了讲与练结合、精讲与多练，包括先讲后练、先练后讲、讲中有练及练中有讲等多种教学方式，让学生切身参与到教学活动中来。实验室既是操作实践室又是多媒体教室，真正做到教、学、做一体化。在教学环节的组织上，应加强讨论式、启发式、参与式的教学[3]，以推动现代教学方式的应用。充分利用多媒体、录像、参观等教学手段，使学生能够在学中做，在做中学。植物组织培养是一门实践性很强的课程[4]，但又离不开理论教学。理论部分主要采用多媒体课件讲解，同时配合录像、实物标本等多种教学形式进行。在实践教学的环节中，边实验边学习，以学生对植物组织培养基本技能的掌握为主，锻炼学生的动手操作和理论联系实际的能力。在讲到组培室的构造及仪器设备的使用时，教师改变老式的讲授方法，放手让学生自主学习，对照设备看说明书，并和同学一起探讨使用方法及注意事项，这样既锻炼了学生的学习能力，又打破了填鸭式的灌输，收到很好的效果。学生做的组培苗分类放置，每次上课时都可以看到他们亲手做的组培苗发生的变化，培养了学习兴趣，提高了动手的积极性。在讲到组培苗的褐化和玻璃化以及组培苗的污染时，可把学生做坏的组培苗单独放置，一边讲解，一边答疑解惑，和学生互动，形象直观，加深了学生对知识的理解。学院还与汉中市植物研究所、汉中市农科所联系，组织学生参观组培中心，使学生对室外炼苗移栽和马铃薯微型种薯的培育等一整套组培技术有了系统的、直观的认识，把枯燥的学习变成了快乐的实践。
3 因材施教，突出重点
汉中职业技术学院生物技术和园林技术同时开课，教学团队根据实际情况，重新编排教材，设计为6个学习情境，教学重点突出在生产上广泛应用的组织培养技术，但根据专业的特点，内容有所侧重。生物技术专业偏重于马铃薯脱毒组培苗和甘薯组培苗，而园林专业则偏重于花卉的组织培养教学，如菊花、兰花的组培技术。教学过程从简单到复杂，循序渐进，一步步掌握组培技术并上升到高层次的对整个专业认知。
4 人人参与，培养集体意识
由于学生水平层次不齐，学习态度不一。所以在组培课上，把学生按照男女性别、学习能力和动手能力的高低进行交叉搭配分组，相互配合共同完成项目任务，通过合作，每个人都有了锻炼机会，都参与到课程情境中，增强了责任心，提高了团队意识，提升了班级凝聚力。
5 实行学习与考证相结合制度
为了更好地适应社会发展的需要，该门课程采取学习与考证相结合的制度，设有培养基制作工、接种工等工种技能鉴定，考核合格后发放相应工种资格证，通过率达到97%，实现了技能训练和生产实战一体化，获得了用人单位的一致欢迎和好评。
6 积极完善，不断创新
虽然组培课教学在短短一年的时间里就有了如此大的进步，但由于条件有限，还有许多需要改进的方面：一是要进一步加大实验实训投入，增加实验设备，建立专用温室大棚，为组培课的教学实训提供良好的配套条件。二是要进一步搭建产学合作平台，和科研单位紧密合作，充分利用本行业的企业资源，开展社会服务，走向社会化，真正做到学以致用。
摘 要：文章在对苔藓植物的特征及组织培养研究简史进行简要介绍的基础上，重点介绍了国内外学者对苔藓植物组织培养材料及基质的选择、外植体的消毒方法、培养基成分的选择及培养条件的筛选等4个方面的研究进展。
关键词：苔藓植物；组织培养；消毒方法；培养基
苔藓植物是植物界中比较特殊的一个植物类群，主要生活在阴湿的环境中，是一类由水生向陆生过渡的重要的原始高等植物。苔藓植物生活史为典型的异型世代交替，孢子体则寄生于配子体上生活，孢子在产生新的配子体过程中还需要经过一个原丝体阶段。目前，全世界大约有2.3万种苔藓植物，其种类仅次于被子植物。
苔藓植物能够蓄积大量水分，因此对水土保持与涵养、森林及某些附生植物的发育都有极其重要的作用。此外，苔藓植物还含有脂类、萜类、黄酮类、生物碱、醌类等活性物质，因此具有极高的药用价值。
苔藓植物的组织培养历史可以追溯到1902年Haberlandt的研究和1905年Goebel等人的研究，此后的50余年时间内，科学家的关注点更多的集中于被子植物组织培养上，对苔藓植物的组织培养几无涉及。1957年，Allsopp利用石地钱和小叶苔的孢子进行组织培养，首次成功获得相应愈伤组织及再生叶状体。此后，世界范围内的关于苔藓植物组织培养的实验研究逐渐展开并取得了一定的成果。
1 苔藓植物组织培养供试材料及基质
目前，可以用于苔藓植物组织培养的材料主要是苔藓植物的配子体、孢子体和原丝体，此外还可以利用其生殖器官、芽孢、游离原生质体等。1960年，Ward以Knudson培养基培养金发藓和波叶仙鹤藓的孢子并获得其无菌原丝体，并在添加了蔗糖的基本培养基中利用该无菌原丝体诱导获得了相应的愈伤组织及再生植株。2003年，高永超等利用牛角藓配子体茎段诱导获得相应愈伤组织，并探讨了蔗糖及大量元素对愈伤组织细胞生长的影响。2007年，于传梅利用膨叶唇藓苔和溪苔的叶状体、柳叶藓的茎段、短叶藓和江岸立碗藓的孢子进行组织培养，获得了相应的愈伤组织或再生植株。
2 苔藓植物组织培养供试材料的消毒
可用于苔藓植物外植体消毒的试剂包括乙醇、次氯酸钠、升汞等，不同的供试材料和不同部位的外植体所用消毒剂有所不同。 Saboljevic等研究表明，适用于Aloina aloides孢子和配子体消毒的次氯酸钠浓度分别为120.00g・L-1和90.00g・L-1。于传梅（2007）研究表明，适用于膨叶唇藓苔和溪苔的叶状体消毒的试剂为0.1%次氯酸钠，消毒时间为5分钟。梁书峰（2010）研究表明，适用于真藓外植体消毒的方法是：先用70%乙醇处理5秒，然后用5%次氯酸钠处理30秒钟，其外植体存活率可以达到70%；而适用于东亚砂藓外植体消毒的方法则是0.1%氯化汞消毒5秒或10秒，用次氯酸钠消毒会导致东亚砂藓外植体变红而无法存活。
3 苔藓植物组织培养供试材料培养基成分的选择
目前，用于苔藓植物组织培养的基本培养基如苔藓植物组织培养常用的培养基有MS培养基、Knop培养基及Benecke培养基等。适用于不同苔藓植物外植体培养和植株再生的基本培养基的种类不同，培养基中的成分也有所不同。RANI的研究表明，最适宜促使小珠藓配子囊形成的GA3浓度为10-7mol・L-1。陈静文（2006）对小立碗藓组织培养研究结果表明，适于小立碗藓组织培养的培养基为添加有0.5%葡萄糖和0.8%琼脂的K2培养基。于传梅（2007）研究表明，适用于短叶藓包子萌发的培养基为分别添加了1%蔗糖和琼脂（pH6.2）的Knop培养基或Benecke培养基。魏志颖（2015）研究表明，Beneck培养基最适于山墙藓原丝体扩展及配子体生长，培养基中琼脂含量与山墙藓生长速度呈现负相关，蔗糖可明显促进原丝体的形成和扩展生长，当蔗糖浓度为15g・L-1时，分化产生的芽体数目最多，培养基中的IAA、IBA、2，4-D可以显著促进山墙藓茎部伸长生长，但2，4-D同时会加速其衰老，6-BA则会促使茎尖端细胞膨大成球状，KT则可以诱导产生愈伤组织。
4 苔藓植物组织培养供试材料培养条件的选择
影响苔藓植物组织培养的培养条件有很多，如温度、光照、pH、水分和湿度等，不同的苔藓植物材料在组织培养中对上述条件要求有所不同。Vashishta（1987）在25℃条件下对3种苔藓植物组织培养研究表明，光照强度为3500lx时，3种苔藓植物原丝体均开始生长并发育良好，且产生芽数也最多。陈静文（2006）对3种藓类植物组织培养的研究表明，适于真藓和小立碗藓生长发育的培养条件是（25±1）℃，3500lx和光照周期为12h/12h；适于小蛇苔组织培养的条件是（18±1）℃，3000lx和光照周期为12h/12h。刘应迪等（2001）对3种藓类植物组织培养研究表明，适于垂藓和大羽藓生长发育的湿度为70～80%，而适于湿地匍灯藓生长发育的湿度则为80～90%。崔巍（2012）对毛尖紫萼藓的组织培养研究结果表明，适于毛尖紫萼藓原丝体生长及配子体再生的温度为（23±1）℃，最适光照条件是3000lx和光照周期为12h/12h，适于其原丝体生长的Prat培养基pH为5.5，而适于其进行扩展生长的Benecke培养基pH则为6.0。
目前，国内外对苔藓植物组织培养的研究还相对较少，且研究内容也多局限在孢子萌发或原丝体发育方面，对其继代培养及扩大培养则研究较少，未来的苔藓植物组织培养可以更加侧重于这一方面，以此从苔藓植物中获取更多的对人类有益的次生代谢产物及抗逆基因，使其更好的为人类服务。
作者简介：郑艳冰（1976-），女，黑龙江省黑河市人，副教授，硕士研究生，主要从事植物遗传学研究。
摘要：以西南凤尾蕨（Pteris wallichiana）的成熟孢子为外植体，以MS、1/2MS为基本培养基，研究了植物生长调节素对西南凤尾蕨离体组织培养的影响。结果表明，不同细胞分裂素和生长激素配比对西南凤尾蕨的组织培养影响不同，最适诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；最适增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L，最高增殖倍数为7.05倍；最适生根壮苗培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，生根率达到90%以上。
关键词：西南凤尾蕨（Pteris wallichiana）；植物生长调节素；组织培养
西南凤尾蕨（Pteris wallichiana），为凤尾蕨科凤尾蕨属大型陆生植物，生长于海拔800～2 000 m的林下沟谷或林缘，分布于中国西南及台湾、广东、广西等地[1]。其味苦、涩、性凉，具有清热止痢、定惊、止血的功能，主治痢疾、小儿惊风、外伤出血等症[2]。西南凤尾蕨叶形优美、叶色青翠碧绿，具有较高的园林观赏价值和药用价值。药用蕨类植物含有生物碱、黄酮类、酚类等多种活性物质，对多种疾病具有明显的治疗作用[3]。
随着观赏植物的发展和对蕨类药用植物的利用，人们对蕨类植物的需求量日益增大。由于繁育技术不过关，野外采挖对野生蕨类植物资源造成严重的破坏，人类活动的干扰加之植物本身的原因使蕨类资源受到威胁[4]。在传统的繁殖方法上，蕨类主要是依靠孢子繁殖和分株繁殖，而孢子繁殖在自然环境中的成苗率很低，分株繁殖则需要时间长并且得到的有效苗数量少，不能在短期内满足大量种苗的需求[5]。因此采用生物组织培养技术，可以有效在短时间内提高西南凤尾蕨的繁殖速度和质量。为了更好地开发西南凤尾蕨中药资源和观赏价值，本研究通过在培养基中添加不同的植物生长调节素，对西南凤尾蕨优良植株组织培养技术进行探讨和研究，为西南凤尾蕨的组培快繁提供技术基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试西南凤尾蕨样品采自广西壮族自治区药用植物园科研基地内野生健壮无病虫害的植株，选取其成熟孢子为外植体。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体的消毒 取西南凤尾蕨带有成熟孢子的叶片，先用流水清洗叶片表面尘土污垢，然后用洗洁精溶液擦拭，并置于烧杯中进行流水冲洗15～20 min，再移至超净工作台上，用75%乙醇灭菌15～20 s，无菌水冲洗1 遍，用0.1% HgCl2浸泡8～14 min进行消毒，无菌水浸泡清洗3～4 次，每次约5 min，清洗时用玻棒不断搅拌，利于彻底洗出汞。然后将材料移置于灭菌的器皿内，用无菌滤纸吸干叶片表面水分后，用消毒好的解剖刀将孢子接种到培养基中。
1.2.2 培养基的选择 孢子诱导、继代增殖培养基以MS为基本培养基、添加蔗糖30 g/L、琼脂4 g/L，同时设不同的激素配比，孢子诱导培养基的激素配比分别设置为：6-BA 0.5 mg/L+NAA（0.1、0.5、1.0）mg/L；6-BA 1.0 mg/L+NAA（0.5、1.0、1.5）mg/L；继代增殖培养基设不同激素配比的配方为：6-BA（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 1.0 g/L；6-BA 1.0 mg/L+NAA（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0） mg/L+AC 1.0 g/L；生根培养基以MS、1/2MS为基本培养基，并在每升加入蔗糖30 g、琼脂4 g，设不同激素配比4种，分别为：MS+NAA 0.5 mg/L、MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L、1/2MS+NAA 0.3 mg/L、1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +NAA 0.5 mg/L。以上培养基的pH均为5.8。
1.2.3 培养条件 设置其培养条件为温度（25±3） ℃，光照度20～30 μmol/（m2・s），光照时间12 h/d，进行孢子离体诱导、继代增殖与生根培养。
2 结果与分析
2.1 消毒条件的筛选
以0.1% HgCl2为消毒剂，设计1组消毒时间试验，分别设置5、8、11、14和17 min 5个时间梯度，将外植体接种于培养基20 d后统计污染率和成活率。结果（表1）表明，样品经0.1% HgCl2溶液消毒时间11 min时，消毒的效果最好，成功率达到80%。处理时间大于11 min时污染率降低，但死亡率明显的上升，当消毒时间为17 min时死亡率高达70%。而处理时间小于11 min时死亡率下降，但污染率较高，不利于外植体的诱导萌芽。
2.2 孢子离体诱导试验
以MS为基本培养基，采用不同的激素配比对孢子进行离体诱导，试验结果见表2。结果表明，当6-BA浓度不变时，添加不同浓度NAA对西南凤尾蕨的孢子诱导产生影响，当NAA浓度在0.1～2.0 mg/L时，随着浓度的升高，有利于孢子的诱导，形成的芽苗质地紧密，数量较多。6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L组合时孢子的诱导率最高，试验重复多次均得到相同的结果。
2.3 不同外源激素对西南凤尾蕨苗继代增殖的影响
将西南凤尾蕨的无菌芽接入含有不同激素配比的继代增殖培养基上，每天观察接入芽的微小变化，10 d后逐渐萌发出新芽，继而芽数慢慢增多，30 d后进行统计和观察芽苗增殖的情况。结果（表3）表明，在6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L的继代培养基上，对西南凤尾蕨的叶丛增殖有明显的促进作用，在NAA 0.1～1.0 mg/L浓度范围内，随着NAA的浓度增大，增殖系数不断增大，但当NAA增加到1.5 mg/L时增殖系数反而有所下降。在B8号（6-BA 1.0 mg/L +NAA 1.0 mg/L+AC 1.0 g/L）培养基中，苗的叶片浓绿，生长情况良好，该培养基中增殖倍数最大，且植株健壮，芽苗的质量较好。
2.4 不同外源激素对西南凤尾蕨苗生根的影响
将诱导出的继代苗单切接入不同激素组合的西南凤尾蕨生根培养基中，培养30 d后进行观察并统计生根率。结果（表4）表明，西南凤尾蕨试管苗在添加不同浓度生长激素的MS、1/2MS培养基上均能生根，苗的颜色浓绿，有少数的苗根部出现微黄，观察发现4种生根培养基诱导生根的情况，根粗大小依次为C4、C3、C2、C1，在生根培养基C4中生根效果最好，植株粗壮呈墨绿色，平均根数16.3，平均根长3.07 cm，平均的苗高8.1 cm，生根率均达到90%以上。而以1/2MS为基本培养基的生根培养基无论在生根率、根粗和苗高都优于MS为基本培养基的生根培养基。
2.5 再生苗的移栽
将西南凤尾蕨的试管苗经过壮苗生根培养后，挑选生长旺盛、健康根系发达的试管苗移入温室内放置，松开盖子并保持瓶内水分充足。3 d后取出试管苗洗净根部培养基，移栽于栽培的基质中，每天喷洒少量的水，基质以排水良好，不易发霉为宜。同时适度的遮阴，保持一定的湿度。移栽15 d左右，叶片开始慢慢的舒展，2个月后成活率达到90%。
3 小结与讨论
在培养基中添加不同生长调节素如细胞分裂素和生长素，细胞分裂素常与生长素相配合，用以调节细胞分裂、细胞伸长、细胞分化和器官形成，是植物快速生长所必需的因素，是诱导植物产出芽、生根的关键因素[6，7]。不同植物或同一植物在不同的培养阶段组织培养体系所需要的生长调节素浓度和种类的组合配比是不相同的[8]。
本研究采用孢子进行离体诱导试验，发现孢子在6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L配比的诱导培养基中，获得了较为理想的协调作用效果，出现绿芽点进而形成叶丛团。研究表明，多种植物生长调节素之间的协同作用要比单独一种激素的使用效果更好[9]。本研究结果也表明，在西南凤尾蕨的芽苗增殖和生根的培养中，6-BA、NAA的配合使用更利于西南凤尾蕨的生长。此外，还受到光照度、活性炭、温度的影响。适当的调整光照度，不仅有利于植物的生根，还能对株高和增殖率产生促进作用。活性炭能清除培养基中植物组织在代谢过程中产生的对培养物有不良或毒副作用的物质，提高培养物体内可溶性蛋白和总糖的含量，以利于植物的生长[10]。在试验中发现，西南凤尾蕨在培养一段时间后，底部会出现褐化的情况。相对而言，在培养基中添加适量的活性炭能减少西南凤尾蕨试管苗的褐化现象。
摘 要：全国职业院校技能大赛推动了职业院校专业的教学改革，《植物组织培养》课程以植物组织培养比赛项目为依托，根据技能大赛竞赛试题，参照相关的职业资格标准、行业标准和技术领域的职业岗位（群）的任职要求，对课程内容、课程的组织与实施、教学方法与考核评价等方面进行了探索与实践。
关键词：植物组织培养；职业技能大赛；课程改革
全国职业院校技能大赛“植物组织培养”赛项通过竞赛实际操作，检验参赛选手在真实的工作环境与条件下进行植物组织培养技术的操作能力和选手的职业素质，操作技术主要考核母液配制、培养基制作、无菌转接3个基本能力。通过竞赛检验高职学生进行优良品种和无病毒苗木的快速繁育和培育的能力，培养他们的团队合作能力，从而提升学生的职业能力；在推进学校与企业合作的同时实现工学结合的人才培养模式，推进园林园艺类专业建设与教学改革，培养行业高素质技能型人才。自2011年以来，“植物组织培养”赛项共组织了3次全国大赛，即2011年、2012年和2014年。我院共组织参加省赛3次，分别在2011年获得省赛三等奖，2012年获得省赛三等奖，2014获得省赛二等奖，并取得国赛二等奖。作为植物组织培养赛项的指导老师，笔者在6a来全程指导训练与教学工作，不断进行新的教学探索和尝试。
《植物组织培养》课程教学改革以技能大赛为锲机，结合学院2012年的第3轮教学改革，进行项目化教学改革，项目组成员2013年参与编写“A”联盟项目化教材。课程教学改革旨在以赛促改，以赛促教，以赛促练，以赛促学[1]。课程考核改变传统的以理论试卷为主的模考核式，加重技能考核比重，结合平时考核、笔试、实际操作等多种考核形式，合理评定学生的成绩。
1 技能大赛背景下课程教学内容的选取
全国职业院校技能大赛是引领职业院校教学改革和技术创新的重要手段[1]。植物组织培养竞赛项目是体现新知识、新技术、新技能的竞赛，竞赛试题以国家职业标准规定的知识和技能要求为基础，结合高职技能型人才培养要求和农业生产岗位需要。
植物组织培养项目比赛内容主要包括MS母液化合物配制、MS培养基配制（不需灭菌）及马铃薯组培苗继代培养的无菌操作。技能比赛主要是要求学生熟练使用组织培养相关仪器设备，能进行种苗的工厂化生产和管理[2]。本课程根据技能大赛中出现的试题、设备和技能考核内容，开发符合高职学生职业能力培养、体现专业技能应用的实训项目[3]。按照课程内容与职业标准对接、教学过程与生产过程对接、学历证书与职业资格证书对接的要求，围绕工作岗位所需知识和能力进行课程教学，以培养职业能力为本位，结合三级花卉园艺师职业资格标准和全国职业院校技能大赛竞赛项目，重新组织和设计教学内容（见图1）。例如，大赛的一个技能考核内容为马铃薯脱毒苗继代繁殖的无菌操作，本课程根据该考核内容，重新对课程内容进行规划，调整并增加了马铃薯试管苗的脱毒实训项目。
图1 课程模块与学习项目设计
《植物组织培养》课程采用基于工作过程的课程设计思路，按照植物组织培养岗位对从业人员知识、能力和素质要求，以植物组织培养的工作过程和工艺流程安排教学，组建教学项目，在教学模块中穿插进各岗位技能，使培养的学生能够独立从事植物组织培养各个岗位的工作[4]（见图2）。
图2 企业工作流程与典型任务分析
2 教学模式与方法
根据课程教学目标和内容的设置，建立理论与实践相结合的课程体系[5]。理论教学与实践教学相结合即实践课与理论课一体化，边理论、边实践，理论够用，实践求精，实践教学课时占到总课时数的50%以上，并形成相对独立的实践教学体系，在实践教学中挑选出几项基本技能，反复操作，不断强化。
实施实践教学过程中，以小组为单位，每小组有2名学生组成（参照技能大赛要求）。教学过程为：（1）各小组领取工作任务单；（2）小组成员自己明确每个成员的任务；（3）查阅资料及教师示范完成上述工作任务单实验，并写出相应的操作步骤（课余完成）；（4）方案实施：依照具体的方案实施；（5）评估：在实施过程中，存在哪些问题并及时解决这些问题；（6）检测：学生对所做实验结果进行成果展示，教师加以考核。
实践教学分小组训练（2人一组），增加操作的反复次数，单人考核；定期开展技能比赛，结合每年11月份的学院技能大赛（原科技创新节）进行课程操作考核，同时备选第2年的省技能大赛选手。植物组织培养操作考核内容与技能大赛接轨，也主要包括MS化合物母液配制、MS培养基配制及组培苗继代培养的无菌操作。
3 “理实一体化”项目化教学教材建设
项目组成员参与编写高职高专规划教材《植物组织培养》（汪本琴主编），并选作教材。该教材将理论和实训结合起来，以任务驱动引出理论知识，以单元实训目标进行实训安排；教材的侧重点在操作技能，理论以够用为度，根据实训需要解决的问题，引出理论知识；要求理论知识浅显易懂，简洁明了，可操作性强。
4 教师队伍建设
高职技能大赛植物组织培养项目考察更多的是学生的技能水平，这不仅为老师提供了非常好的自我检验的机会，也对教师提出了更高的要求，从根本上扭转了教师过去那种重理论、轻技能的教学思想。技能大赛使指导老师认识到学生技能培养的重要性，树立起技能教育的理念[6]。技能大赛要求指导教师在具有良好专业知识素养的同时，具有较高水平的操作能力、较强的项目设计与指导能力以及良好的教学组织能力，能引导学生自己发现知识、提高技能。我院教师队伍培养通过参与科技服务项目、考评员培训、参与校内外实训基地建设等等，提高教师的专业实践技能。在植物组织培养课程的教学过程中，由课程负责人组织建立了一个教学团队，丰富实践经验的企业专业技术人员、实验室管理人员和企业能工巧匠参与实践教学，共同制定教学大纲、教学计划等，并集中对学生的基本技能和提升技能进行专项讲解和训练，在提高学生的专业技能的同时建立一支结构合理、素质优良、技术过硬的专兼职结合的教师队伍。
5 教学质量评价体系
课程考核采取以过程性评价为主的多样化评价措施。评价考察学生在知识、技能、素质方面是否达到目标，全方位、多角度的反映一个学生的真实成绩和综合能力[3]。过程考核是教师结合每个学生在完成各个典型工作任务时的具体表现，考核的指标涉及学生的出勤，资料准备情况、任务分工合理情况、项目实施过程的完成效果及速度、报告总结及成果展示等方面。以技能考核为主，分多次进行，贯穿于整个教学过程中。最后综合理论考试、平时考核和技能考核等几项成绩给学生一个综合的评价。本课程考核具体做法为：过程性评价（60%）+终结性评价（40%）。其中过程性评价中岗位技能（即随堂现场考核）60%，学习过程40%（其中考勤20%，实验报告和总结20%）。终结性评价即期末测试，其中技能操作考核50%，理论笔试50%。这样的考核方式不但调动了学生参与学习的积极性和主动性，而且充分体现了职业教育学生为主体的特点，有利于全面培养学生的职业能力。
6 结语
植物组织培养技术广泛应用于优良品种快繁、脱毒种苗生产、种质资源保存等方面[2]。“植物组织培养”赛项推动了高职院校园艺技术、园林技术等专业的教育教学改革。我院植物组织培养课程团队通过组织参加技能大赛，不断提高自身能力，改革课程教学，更新教学内容，教学过程主要在组培实验室中进行，实践教学时分组训练，单人考核，并在课堂开展技能考核。技能大赛使课程教学团队进一步明确了教学标准，并把实践教学训练体系做实、做细；技能大赛使学生对职业操作规范、产品质量标准和操作水平有了明确的认识，加快了学生职业技能的发展、专业技能的提高和加强了团队合作的意识。随着植物组织培养技术的快速发展和我国教育教学改革的深人实施，只有不断探索和采用具有创新性的教学理念、方法和手段，才能充分调动学生学习的积极性，提高学生的职业能力。
摘 要：本试验以报春花叶片、茎段作为外植体，进行了初代组织培养，并进行增殖、生根培养。结果表明：75%的酒精（0.5 min）+0.1%升汞（8 min）具有很好的消毒作用;MS +6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1是不定芽分化的最佳培养基配比;MS+6-BA 1.0 mg・L-1 +NAA 0.2 mg・L-1是不定芽增殖的最佳培养基配比;1/2MS+NAA 0.2 mg・L-1是生根的最佳培养基配比。
关键词：报春花;外植体;培养基
报春花 （Primula malacoides Franch.）又名小种樱草、七重楼，报春花科报春花属，叶片长卵形或圆形，叶缘有齿，叶柄长5 cm左右。花葶高20～30 cm，花冠高脚碟状。多生长于荒野、田边，原产于中国的云南、贵州，各地栽培，颇具观赏性。
报春花原产中国，草本植物。喜气候温凉、湿润的环境和排水良好、富含腐殖质的土壤，不耐高温和强烈的直射阳光，多数亦不耐严寒。叶基生，全株被白色绒毛。花通常2型，排成伞形花序或头状花序。花期为12月至次年4月，早春开花为本属植物的重要特性，其中文名报春和学名均含有早花的意思。近年来发展很快，已成为当前一类重要的园林花卉。
组织培养又叫离体培养，通常指从植物体中分离出符合需求的组织（器官、细胞、原生质体等），在人工无菌操作条件下，进行培养从而获得再生的完整植株，或者生产出具有经济价值的其他产品的技术。本试验以报春花叶片、茎段为外植体，进行了初代组织培养，并进行增殖、生根培养，在建立报春花组织培养无菌体系的基础上，对比了外植体不同灭菌方法对灭菌效果的影响，以及不同激素浓度对报春花叶片、茎段芽分化、不定芽增殖及其生根的影响。
1 材料和方法
1.1 试验材料
使用材料取自盆栽报春花的叶片和茎段。
1.2 试验材料的处理
组织培养前，先从室内培养的盆栽植株上取生长旺盛的报春花叶片和嫩茎作外植体，取材后放入烧杯里，用大量的水洗去表面附着物后，再放到自来水管下进行二次冲洗（时间约60 min），然后放入到瓶中，在超净工作台上再迅速用无菌蒸馏水冲洗3遍后等分为2份。每种消毒剂处理15瓶，每瓶接种4块，处理方法见表1。最后，用无菌蒸馏水冲洗6次。将叶片横切和纵切后切成1 cm×1 cm大小，将嫩茎切成1 cm左右的茎段作外植体用。
1.3 培养基配比
基本培养基为MS，琼脂为6 g，蔗糖浓度为3%，pH 值为5.8。初代培养基为：（1）MS+6-BA 0.5 mg・L-1+NAA 0.1 mg・L-1;（2）MS+6-BA 0.5 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1;（3）MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.1 mg・L-1;（4）MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1;（5）MS+6-BA 2.0 mg・L-1+NAA 0.1 mg・L-1;（6）MS+6-BA 2.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1。增殖培养基为：（7）MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.1 mg・L-1;（8）MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1。生根培养基为：（9）1/2MS+NAA 0.1 mg・L-1;（10）1/2MS+NAA 0.2 mg・L-1。培养室内温度为（25±2） ℃，光照强度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，补光灯在光照不够的条件下及时补光。
2 结果与分析
2.1 不同消毒剂处理的消毒效果
进行初代培养10 d后对120瓶培养情况进行统计，结果见表2。处理Ⅰ、处理Ⅱ的消毒效果差异明显，处理Ⅱ的消毒效果是处理Ⅰ的17倍，因此单独使用酒精对报春花外植体进行消毒处理，污染率高，效果不太好;而用70%酒精（0.6 min）+0.1%HgCl2（10 min）对报春花外植体消毒效果明显。
2.2 不同外植体诱导愈伤组织的时间
经过初代培养10 d后，对每种培养基中茎段和叶片愈伤组织形成情况进行统计，从表3可看出，由于培养基配比不同，如果培养基配比合适，报春花叶片在第11天就可以形成愈伤组织，而茎段需要在第15天左右才能形成，其诱导时间比用叶片作为外植体的时间要长约4 d左右。
2.3 激素对初代培养的影响
将经过消毒组合Ⅱ处理好的外植体接种到初代培养基1～6，培养11 d后，大部分叶片的切块边缘首先开始膨大，长出淡绿色的愈伤组织，并呈疏松的颗粒状，有部分叶片在切口处直接产生不定芽;接种20 d后愈伤组织表面出现绿色芽点，开始分化出0.2～0.5 cm的不定芽，35 d后顶芽萌动并长出侧芽和分枝。
表4是第36天出芽的外植体统计数，激素的影响由表4中可以看出。在培养过程中还发现，当6-BA 2.0 mg・L-1、NAA0.1 mg・L-1时，在后期出现部分芽苗玻璃化、失绿现象;当NAA 0.2 mg・L-1、6-BA 2.0 mg・L-1时，分化出的不定芽形态明显弱小;当6-BA 1.0 mg・L-1、NAA 0.2 mg・L-1时，诱导率较高，而且芽苗生长健壮，芽苗利用率也好。因此，初代培养的最适培养基配比为MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1。
2.4 激素对增殖培养的影响
将初代培养得到的芽丛和分枝切割成带1～2个节的小段，转接到培养基7～8上，约15 d后，就可以不断长出大量的芽和分枝，培养基7和8中的芽都有增殖，但是培养基配比8的效果好，分化丛生芽芽体健壮，数量多，长势良好，适合叶、茎段的继代培养。当NAA为0.1 mg・L-1时，有部分芽生长良好，但部分芽体长势较略差，长不高，影响丛生芽的大量继代增殖（表5）。
2.5 激素对生根培养的影响
切取分化增殖所得到的高约2～3 cm生长健壮的丛生芽苗，将分枝切成带有2个节的茎段，转接种到添加不同浓度NAA的生根培养基9～10中。在生根培养进行到第30天的时候，对丛生芽的生根情况进行了统计，结果见表6。
当在1/2MS基本培养基中添加NAA浓度为0.1 mg・L-1（培养基9）时，生根率为85.0%，平均生根数达到12.6条，根长为1. 0 cm左右。当添加NAA浓度为0.2 mg・L-1（培养基10）后，诱导的丛生芽生根率升高，达到97.5%，平均生根数有13.8条左右，并且根粗壮，苗长势良好，根长为1.4 cm左右。
3 结论与讨论
由于报春花叶片肉质光滑，易于表面灭菌消毒，无菌操作简单，切割过程也容易操作，瓶苗移栽后管理较粗放，组培繁殖极易见效率，经济效益亦是可观的。
因为植物体表面常附有各种各样的微生物，无菌操作过程中，对于植物材料表面的消毒尤为重要，因为一旦带进培养基，微生物就会迅速滋生造成植物材料死亡。75%酒精（0.5 min）+0.1%HgCl2（8 min）的消毒处理有更强的杀菌能力和穿透力，而且有湿润作用，对报春花叶片和茎段的消毒处理效果明显。
植物激素的种类和配比，是使植物组织分化出苗和快速增殖的重要因素，通过此次不同梯度培养基配比，发现虽然都能使植物分化出苗和增殖，但是低浓度和高浓度的激素配比使植物分化出苗较慢，同时细胞分裂素和生长素比例过高，导致玻璃化苗的产生，其中MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1激素配比最佳，利于报春花愈伤组织的生长和分化，进行初代培养;MS+6-BA 1.0 mg・L-1+NAA 0.2 mg・L-1是最有利于增殖的培养基;最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg・L-1。
【摘 要】植物组织培养是一门实践技能要求极高的专业课程，将开放性实验应用于植物组织培养教学改革中，是为了更好地进行课程建设，培养学生的创新能力，提升学生的综合素质。
【关键词】开放性实验 教学改革 植物组织培养
植物组织培养是一门以基础理论知识作为指导，以准确直观的实践操作为衡量标准的理实一体化课程。对于教学而言，相较于基础理论知识，实践教学显得更为重要。随着传统实践教学模式固有弊端的凸显，因材施教、分层教学的开放性实验教学模式逐渐成为教学改革的发展方向。
一 植物组织培养教学改革
1.植物组织培养课程的特点
第一，实验课程比重大。植物组织培养是指采用无菌操作方法，培养植物的离体细胞组织、器官，使其再生成为完整植株的技术。植物组织培养是以操作技术为核心，实验技能要求很高的课程。因此，实践教学模式很大程度上决定了这门课程开设效果的成败。第二，前沿科技对课程冲击很大。植物组织培养技术起源于20世纪初，在快繁种苗等多个方面取得了巨大的成绩。随着前沿科技的不断更新，植物组织培养技术的发展也是日新月异，教学本身也存在着知识更新问题。
2.植物组织培养课程中存在的问题
植物组织培养是在科学实验和生产实践中发展起来的新型学科，是实验技术性较强的学科之一，教材虽然历经数次修订，但目前仍存在不少问题。第一，理论教学比例过重，实践技能熟练度不高。相较于理论教学的扎实，实践技能培训成为教学的薄弱环节。由于师资力量的不足、课时安排的限制等问题，学生的实际操作能力远远低于企业要求。第二，学校教育与社会生产的脱节。企业为了保证生产效益，所采用的是最先进的设备仪器及最顶尖的生产工艺。相较之下，学校从实验设备到理论知识都是无法和企业相提并论的，这也造成了这门课程教学的另一难题。
二 开放性实验的开展
开放性教学是一种从时间、地点、内容、方法和手段上对学生全方位开放的教学模式。开放性实验是以“学生为核心、教师为辅”，强调在基础性实验的前提下，合理设计教学方法，以调动学生主动参与实验为目的。
1.开放性实验与传统实验的异同
第一，开放性实验与传统实验的联系。开放性实验是以传统实验为基础的。在传统实验中存在部分验证性的基础实验，其目的是要学生熟悉操作规范、掌握实验的基本技能以及提高实验效率。只有充分掌握了实验的基本技能，才能通过阅读大量资料、结合操作技能、合理设计实验并严格且完善地开展实验。开放性实验是基础实验的总结、提高和升华。第二，开放性实验与传统实验的区别。（1）目的不同：传统实验主要以验证为目的，开放性实验不是看重结果，而是追求在整个实验中学生所表现出的能力。（2）主体不同：传统实验是以教师为主导，学生只需按照实验指导书做实验。而在开放性实验中，学生才是主体和主导，教师从旁协助，适当地提出修改意见，并不参与实验步骤的制定、仪器的选择等具体环节。
2.开放性实验的实现
第一，开放性实验室的建立。随着开放性实验的发展，实验室的地位日益提高，广大师生迫切要求实验室运行方式的突破。建设开放性实验室不能局限于时间和空间上的开放，更为重要的是教学体制、内容、方法、观念上的开放。开放性实验室的建立不仅有利于实践教学改革，也能充分利用实验设备仪器，同时有助于学生综合素质的提升和教师专业领域及教学水平的提高。第二，考核方式改革。开放性实验教学要求教师具备更高的知识素养、操作能力、协调能力以及灵活应变的能力，教学设计成为重中之重。学生在设计实验、完成实验以及实验后的分析总结，都可以体现学生的学习能力和对知识点的把握。因此，考核模式不仅应看实验结果，也应该结合整个实验过程本身。强化对学生实验过程的考核，既是充分调动学生实验的积极性，也使考核更加完善和科学。
三 开放性实验在植物组织培养教学改革中的探索
1.确定典型工作任务，优化教学内容
为了达到培养学生综合素质的目的，我们采取了一系列的措施，包括：修改人才培养方案，加大实践教学比重；聘请企业能工巧匠，促进校企结合；优化实验设计，培养学习兴趣；开放实验室，促进学生主动参与实验等。
2.建立开放性实验室
结合本校的基本情况，将开放实验条件较好的基础实验室作为开放性实验室以及加速植物组织培养实验室的建设。具体措施有：购置先进的仪器设备，建立和完善开放性实验室管理的规章制度，组建无菌室等。
3.以赛促改
2014年4月，我系参加了陕西省高等职业院校技能大赛，在植物组织培养比赛中获得第三名的成绩。一方面，比赛促进了我们对开放性教学的重视，成绩也是对我们实践教学改革工作的认可和鼓励。另一方面，学生也更加重视实践操作能力，为日后就业练好扎实的基本功。
综上所述，开放性实验在植物组织培养教学改革中发挥了效果，随着植物组织培养课程改革的逐步完善，开放性实验将会在更多的实践教学中发挥作用。
摘要：以金果榄（Tinospora capillipes Gagnep.）幼嫩茎段为外植体，添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤 （6-BA）、吲哚-3-丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、激动素（KT）、赤霉素（GA），研究不同培养基对金果榄试管苗诱导、增殖和生根的影响。结果表明，金果榄启动培养的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT +0.1 mg/ L 2，4-D，腋芽诱导率达95.1%；增殖的最佳培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA，增殖系数达到16.1；生根的最佳培养基为1/2MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA，30 d时生根率为85.4%，10 d后炼苗移栽到塘泥和河沙（3∶1，体积比）的混合基质中，30 d后移栽成活率可达87.3%以上。
关键词：金果榄（Tinospora capillipes Gagnep.）；茎段；组织培养；诱导；生根
金果榄（Tinospora capillipes Gagnep.）为防己科青牛胆属常绿缠绕藤本植物，主产于四川、湖南、广西、湖北、贵州等地，具有清热解毒、利咽止痛的功效，主治咽喉肿痛、痈疽疔毒、泄泻、痢疾、脘腹热痛等[1-3]。金果榄块根含掌叶防己碱（Palnmtine）和咖伦宾（Colmtfifin）、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、千金藤碱、蝙蝠葛碱和木兰花碱[4-6]等成分，民间广泛用于治疗胃痛。现代药理学研究表明，金果榄有明显的抗炎镇痛、抗菌、抗肿瘤、降血糖、抗应激及解毒等作用，又被喻为可替代抗生素的天然药物[5]。由于长期采挖，金果榄野生资源日趋枯竭，人工种植和抚育势在必行。另外，金果榄雌雄异株，授粉受到环境影响极大，自然结实率低。在资源调查和引种中发现，雄株远多于雌株（约50∶1），结果机会大大减少，且种子有明显的休眠期，发芽率较低[7]。因此，种源缺乏是金果榄资源锐减的主要原因。目前，金果榄扦插繁殖未获得成功，而组织培养快速繁殖是现代生物技术，且在香蕉、罗汉果、石斛等作物上已取得成功[8-10]，并应用于生产，但金果榄组培繁殖研究鲜见报道。利用MS培养基为基础培养基，添加不同浓度和不同种类的激素，在多种植物组织培养中已获得成功。本试验以金果榄的幼嫩茎段为外植体进行消毒，用不同类型植物生长调节物质对丛生芽进行诱导、增殖、生根培养，分析各种植物生长调节物质对金果榄组织培养的影响，从而为金果榄人工繁殖和大规模推广栽培提供有利依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验以广西药用植物园科研圃栽植的金果榄多年生幼嫩枝条为外植体材料。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 将生长旺盛、无病虫害的金果榄多年生幼嫩枝条剪下，剪成1.5～2.0 cm长且带芽的茎段，放入0.1%的洗涤剂中浸泡8～10 min，然后于自来水下冲洗20 min，取出放入经高压灭菌的无菌水中润洗2次。经以上处理后，再将外植体放入75%的乙醇中消毒30 s，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒7 min， 无菌水冲洗5次。用无菌滤纸吸干材料上的水分， 选择不变色、无褐化的茎段横切成面积为0.8 cm ×1.2 cm 的带芽小块，供接种用。
1.2.2 培养方法
1）启动培养。将经过消毒处理的茎段分别接种在添加了不同组合、不同浓度生长激素的MS培养基上进行启动培养，生长素的类型及浓度为6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、KT（0.5、1.0、1.5 mg/L）、2，4-D（0、0.1、1.5 mg/L），每瓶接种1个茎段，每个处理接种20瓶，3次重复，培养30 d后观察记录诱导效果。
2）增殖培养。将在启动培养基上成功诱导出来的芽进行增殖培养，培养30 d后统计增殖系数。
3）生根培养。将获得的有效不定芽（株高1.5～2.0 cm）接种于1/2MS培养基上进行壮苗培养，培养20 d后转入生根培养基中诱导生根，每个处理接种5株，3次重复，培养30 d后统计生根情况。
4）培养条件。所述培养基均为MS基本培养基（含26 g/ L蔗糖、5.0 g/L琼脂，pH 5.8），培养温度为（25±2）℃ 、光照时间为12 h/d （日光灯，光照度2 000 lx ）。
2 结果与分析
2.1 金果榄茎段启动培养
由表1可知，不同组合生长激素对金果榄茎段的启动培养效果不同，带腋芽的茎段培养10 d左右有不同程度的萌发，6-BA和KT均能起到较好的诱导作用，当6-BA浓度为1.0 mg/L，KT浓度为0.5 mg/L，2，4-D浓度为0.1 mg/L时，金果榄茎段诱导率达到95.1%，但当6-BA浓度一定，KT和2，4-D浓度过高时，诱导的部分丛生芽出现玻璃化现象。培养基中添加2，4-D后，芽的长度明显增长，但部分出现愈伤组织，说明6-BA和KT为金果榄腋芽诱导的主要因素，而2，4-D对腋芽的诱导作用不大，其主要作用在于愈伤组织的诱导。金果榄茎段腋芽萌发的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT +0.1 mg/L 2，4-D。
2.2 金果榄茎段增殖培养
将金果榄带芽茎段接种于附加不同浓度的6-BA和一定浓度GA、NAA的MS培养基中，每个处理接种30瓶，每瓶接种3个茎段，经过2～3周培养可形成大量丛生芽。结果表明（表2），在4号培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA上，金果榄丛生芽增殖系数最大，达到16.1，芽生长状况也较好，虽然5号培养基中丛生芽的生长状况也良好，但其增殖系数比4号培养基低，且出现了少量的愈伤组织，而在不添加任何激素的基本培养基上培养，金果榄丛生芽增殖系数最低，且生长缓慢，丛生芽较细弱。
2.3 壮苗与生根
将4号增殖培养基上诱导出来的金果榄丛生芽接种到壮苗培养基（添加0.5 g/L活性炭、0.1 mg/L IBA）上进行壮苗培养，20 d左右苗可长粗、长壮，然后将长至3～5 cm高的健壮试管苗接种于1～9号生根培养基中， 20 d 左右，苗基部根原基突起；一个月后，从根原基上长出白色新根，每株生根4～10条，根长2.3～7.5 cm。
不同浓度的生长激素及其组合均能诱导组培苗生根，但不同生长激素及其组合诱导苗生根的表现不同。如表3所示，只添加IBA的情况下，随着IBA浓度的增加，金果榄丛生芽生根率提高，生根速度加快，与对照存在明显差异，但根较细小，容易折断，不利于移栽成活；只添加NAA的情况下，金果榄丛生芽生根虽比只加IBA的粗，但生根数减少；以NAA与IBA配合使用可提高金果榄生根率，其生根速度也加快，根粗，根数多，平均生根数最大为9.8±2.33。因此，综合各项指标，在诱导金果榄生根时，以3号生根培养基1/2 MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA为佳，接种后21 d即开始生根，30 d时生根率为85.4%，40 d后可达95%以上。
2.4 炼苗和移栽
炼苗、移栽基质和光照度对瓶苗移栽成活率都有很大影响，金果榄苗高约5 cm时开始炼苗。移栽前先闭瓶炼苗6 d，再将培养瓶盖打开，放到全天自然光照，温度25 ℃的通风条件下炼苗3 d，移栽时用镊子将试管苗从培养瓶中取出，洗干净根部培养基，放入添加了2 mg/L NAA的无菌水中浸泡10 min，移栽入已灭菌过的基质中（塘泥∶河沙=3∶1，体积比）， 移栽后7～10 d用塑料薄膜保湿，上面再覆盖一层报纸，保持光照度以遮光率为60%左右为宜，空气湿度85%以上，每天喷雾1次，10 d左右长出新根，移栽成活率达87.3%以上。
3 小结与讨论
金果榄启动培养的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L KT +0.1 mg/ L 2，4-D，其中6-BA和KT为腋芽诱导的主要因素；金果榄茎段增殖的最佳培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA+0.2 mg/L NAA，生根的最佳培养基为1/2 MS+0.2 mg/L IBA +0.4 mg/L NAA，接种21 d后可开始生根，30 d时生根率为85.4%，可边炼苗边生根，10 d后
[摘要] 为提高药用植物的产量和品质，增强我国药用植物产业的竞争力，该文对药用植物大规模组织培养的现状、存在的问题及对策进行了分析。尽管生物技术是药用植物生产最快捷、最有前途的手段之一，但仍存在诸如培养材料稳定性、转基因药用植物安全性、培养条件优化等方面的问题。因此，针对药用植物自身特点，建立完善健全的评价体系，是保证药用植物大规模组织培养可持续发展的关键举措。
[关键词] 药用植物；组织培养；生物技术
随着市场需求量的日益增涨，药用植物不仅仅应用于传统医学保健和治疗中，还作为化学药品的原料，应用广泛。许多药效显著、需求量大的植物源化学成分在生产上主要依赖于药用植物的提取、纯化，如紫杉醇、青蒿素等。然而，由于生态环境的破坏造成土地和其他自然资源的减少和恶化，以及药用植物有效成分提取效率低下，植物原料质量参差不齐等不足，使得我国药用植物有效成分的生产，面临诸多问题和挑战。借助于先进的科学技术手段，可以提高药用植物的生产效率和品质、减轻资源压力，对增强我国药用植物产业的竞争力，发挥其应有的巨大潜力，并使之能够可持续发展具有重要的意义。
生物技术是药用植物生产最快捷、最有前途的手段之一。应用生物技术进行中药材生产有以下几个优点：①药材（或活性成分）的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤环境等因素的制约，可排除病虫害的侵袭与农药残留量的困扰，严格控制药材质量。②可进行特定的生物转化反应，生产人们需要的活性成分。③通过活性成分生物合成路线进行遗传操纵，提高目的物的产量。④通过加入或删除基因而改变其遗传特性，达到大幅度提升产量或合成新的活性产物[1]。从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质。
由于植物细胞具有全能性，即单个细胞在适宜的环境下可分化发育成植株，并具有整株植物所具有的合成化合物的能力，因此组织培养技术是药用植物大规模生产的重要手段之一。药用植物组织培养的研究工作取得了较大进展：已有百余种植物次生代谢产物通过组织培养技术获得，近半数次级代谢产物的含量超过原植株，部分已进人中试和工业化生产规模。目前这项技术已发展成为一门精细的实验技术，在选材消毒、接种培养、诱导筛选、继代保存、分离鉴定等方面建立了一整套完整的技术方法[2]。越来越多的药用植物已经进入大规模组织培养阶段，本文针对药用植物大规模培养组织培养的现状，对大规模组织培养过程中的相关问题进行了分析和探讨。
1 研究现状
目前，药用植物组织培养主要有2个方面：一是直接培养和收获这些组织和器官，如不定根、不定芽、小鳞茎等。二是通过组织和器官培养获得再生植株，从而进行快速繁殖，生产大量无病毒种苗以满足药用植物人工栽培的需要。近40年来，我国经离体培养获得试管植株的药用植物至少有200种[3]，涉及常用中药和民族药物的基原植物以及珍稀濒危药用植物、等。在利用植物组织培养直接生产药物的研究方面也取得了很大进展，目前从各种培养物中产生的药用成分已有约百余种，其中人参皂苷、人参皂苷元、三七皂苷、甘草甜苷、甜叶菊苷、柴胡皂苷、薯蓣皂苷、熊果苷、莨菪碱、小檗碱、总黄酮、蒽醌等[4]药用成分含量等于甚至高于原植物。
我国以组织培养技术为基础的毛状根培养及其增殖技术也发展迅速，目前已利用人参、丹参、黄芪等建立了农杆菌转化器官培养系统。韩国人参不定根和毛状根的培养已经达到了工业化的程度，所用反应器的规模已经达到了10 t。Jeong等的实验表明，在5 L的生物反应器中，经过39 d的培养，毛状根的生物量是接种时的55倍[5]。黄芪毛状根在3，5，10 L容器中培养，经21 d培养产量（干重）就可达10 g・L-1，黄芪毛状根中皂苷、黄酮、多糖、氨基酸等含量类似于黄芪药材，而粗皂苷和可溶性多糖的含量还稍高于药用黄芪[6]。利用10 L的球状气升式反应器实现了丹参毛状根的大规模培养，并利用 75 L的气升式反应器进行了进一步的放大培养，表明利用气升式反应器进行丹参毛状根初级放大和中试规模的培养是可行的[7]，它为今后丹参毛状根的工业化生产奠定了基础。
2 存在的问题及对策
2.1 培养材料的稳定性重视程度不够 很多药用植物的不定根和毛状根被当成实验材料来进行实验研究[8-9]，同时越来越多的组织培养材料被应用到实际生产中，随着药用植物组织培养的大规模生产，有望为名贵、珍稀濒危植物资源的持续开发与利用以及绿色原料药的生产开辟一条新途径[5-7]。但是由于药用植物组织培养条件、生长因子和操作的不可控性，在培养过程中有可能发生染色体变异，倍性的改变或产生突变体等，这些变异可能对药用植物组织的生产和化学成分产生影响。因此，不能一味的追求生长量，还有必要对培养材料的稳定性进行相应的评价。
目前，有关药用植物组织培养材料的稳定性研究较少，有关组培苗遗传稳定性研究的内容和方法主要包括：①染色体核型和数目分析[10]；②无性繁殖过程中的遗传稳定性[11-12]（RAPD，SSR等）；③对于转基因植株还要检测外源基因存在、整合和表达情况[13-15]（PCR，Southern杂交，western blot杂交等）。
2.2 转基因药用植物的安全性评价及标准有待于进一步确立 药用植物的基因工程与农作物的遗传转化有着不同的侧重点，即在转基因药用植物植株的筛选和评价过程中，转基因事件对药用植物有效成分乃至药效的影响是首要考虑因素。利用根癌农杆菌Ti质粒转化形成的冠瘿瘤组织和发根农杆菌Ri质粒转化形成的毛状根作为培养系统生产有用的植物次生代谢产物，是当今药用植物生物技术研究的热点之一。冠瘿瘤组织和毛状根作为转基因材料，其安全性评价研究一直处于空白状态。
目前转基因植物的安全性问题主要集中在2个方面，一个是环境安全性，另一个是食品安全性。由于药用植物不同于农作物、蔬菜等，因此其转基因安全性评价也应有所不同。首先，在环境安全性方面，由于药用植物冠瘿瘤组织和毛状根均在可控的条件下进行培养，因此不涉及转基因材料作为一个新物种进入生态系统可能对生态平衡产生负面效应的情况。在食品安全性方面，由于一般药用植物的生产仅用于提取有效部位或成分，或者单独作为一味药物来使用，因此除了那些药食同源的药用植物以外，其他可考虑纳入药品的安全性管理体系进行评价和管理。重新评价药物有效性和安全性是转基因药用植物安全性评价的核心内容，但由于大多数中药有效成分和疗效机制不明确，转基因药用植物的药效评价问题成为关键难点问题。
2.3 规模化生产过程中培养条件的优化需重视 愈伤组织诱导、细胞培养、芽分化、继代、生根是药用植物组织培养的主要步骤，严格控制组织培养过程中培养基的各营养成分用量以及激素浓度和配比是保证药用植物大规模生产成功的关键。在培养程序建立之后，遵循植物生长规律对细胞、组织的生长发育进行改进，如通过改变光质来调节外植体的脱分化、再分化以及有用代谢物的产生；配制培养基时采用适合于植物生长的pH；寻找新的碳源代替糖类，以减少污染。在利用组织培养技术进行大规模工厂化生产中，这些问题都需要做更深入的探讨与摸索[16]。
2.4 适合植物组织和细胞培养的生物反应器尚有待研究解决 生物反应器是实现植物细胞和组织大规模工厂化生产的关键因素之一，其具有工作体积大、单位体积生产能力高、物理和化学条件控制方便、不受时间和地点限制等许多优点，这为植物组织培养生产天然产物的商业化开辟了广阔前景。但要真正实现工业化和商业化尚受到来自生物本身和工程技术上的诸多限制，需在以下几个方面加强研究：①根据不同植物组织和器官培养的生物学和工程要求，进一步创新反应器系统和培养工艺；②结合现代分子生物学技术，从分子基因和细胞代谢水平深人探索反应器中微环境对植物组织生长和次生代谢的作用机制；③建立新型植物组织培养反应器系统的放大规律，实现培养过程的工业化；④将反应器培养技术、现代仪器分析手段和智能专家控制系统进行集成，实现植物组织大规模培养过程的在线优化控制和自动化[17]。
2.5 植物次生代谢产物合成途径研究平台建设有待加强 对于药用植物来说，药用植物组织的大规模培养技术不仅是要提高生物量，最理想的应用是能够大幅度提高药用植物有效成分的含量。但是，由于大部分药用植物有效成分的代谢途径并不明确，甚至难以确认具有临床价值的有效成分，因此对药用植物有效成分相关功能基因进行发掘、鉴定等有利于解析其有效成分代谢途径。组织培养技术是进行功能基因基础研究的必要的技术平台，研究和建立高效的药用植物基因转化体系，可为深入研究药用植物有效成分的代谢途径、发掘和鉴定相应的功能基因等提供重要的研究手段，大大提高药用植物的基础研究的水平，从而推动学科的发展。
3 小结
药用植物大规模组织培养技术的研究是多学科交叉综合的结果，涉及到植物化学、分子生物学、生化反应动力学等许多层面。充分利用先进的理论体系作指导，利用生命科学的研究模式[18]，从宏观的形态，药理药效到微观的基因、化学成分来分析和阐述药用植物细胞、器官的性状，从而指导药用植物大规模组织培养的研究与应用。
药用植物大规模组织培养研究和应用具有广阔的发展空间，同时也蕴藏着巨大的经济价值和社会价值。我国具有得天独厚的药用植物资源和市场优势，加强药用植物大规模组织培养研究将有利于我国药用植物资源的可持续利用和发展。与此同时，应依据药用植物自身特点，建立完善健全的评价体系，是保证药用植物大规模组织培养可持续发展的关键举措。
摘要：本文提出了高职《植物组织培养技术》课程项目化教学改革的必要性，在分析了目前课程教学中存在问题的基础上，重新设定教学目标，并应用于项目化教学改革实践，取得了明显成效。
关键词：高职；项目化教学；植物组织培养
近年来，我国高职教育取得了长足的发展。高职教育的人才培养模式已由过去的传统教育方式逐渐向“工学结合、顶岗实习”的模式转变。[1]《植物组织培养技术》课程是园艺技术专业一门实践性很强的课程，依据园艺技术专业工作任务与职业能力分析表中的植物组织培养工作项目设置。其目的是培养学生组建应用性植物组织培养室，应用组培技术进行花卉、苗木等良种快繁与无病毒种苗生产的能力。对于植物生产这一园艺技术专业的核心工作岗位而言，植物组织培养技术打破了传统农业生产模式，技术含量高，经济效益特别突出，具有重要的现实意义。随着现代农业的不断推广，植物组织培养技术必将在植物生产中发挥越来越重要的作用。为实现高职教育园艺技术专业的培养目标，提升学生的就业竞争力，满足企业用人需求，需要进行基于企业真实生产任务的课程项目化教学改革。所谓项目化课程，是指以工作任务（项目）为中心，选择、组织课程内容，并以完成工作任务为主要学习方式的课程模式。[2]本文是对《植物组织培养技术》课程项目化教学改革实践过程中的思考和体会。
一、植物组织培养技术课程中存在的主要问题
原有的植物组织培养课程是以知识传授为主要特征的学科课程模式，根据传统的教材框架，依照植物组织培养的概念与发展等知识点逐步展开。学生学完之后，理论很懂，但无法应用于实际，表现在不能独立组建实验室，不能应用组培技术进行植物生产。实行项目化课程改革以后，针对高职学生特点和培养目标，组培课程的设计思路转变为以“组建实验室应用组培技术开展植物生产”这一核心工作任务为依据，以实验室设计、培养基配制、愈伤组织培养、器官培养、组培工厂化生产这些项目为载体，让学生在完成具体项目的过程中学会完成相应工作任务，并构建相关理论知识，发展职业能力。围绕核心能力构建课程内容。
二、教学目标重新设定
《植物组织培养技术》是园艺技术专业的一门专业平台课，授课对象为园艺技术专业二年级学生。根据工作岗位要求和杭州市部分企业的调研，重新设定了《植物组织培养技术》课程的知识目标、能力目标和素质目标。
三、项目化教学改革实践
（一）教学内容
教学项目的设定应该将理论知识和实践技能结合在一起，与企业实际工作有直接关系，并且具有一定难度。[3]按照这样的要求，具体教学项目设置如表2。
（二）教学方法
教学体现培养学生职业岗位能力和创新精神，不拘泥于课程体系的完整性和学科性，而突出植物组织培养职业岗位的实践作为取舍教学内容的依据。将单项操作与综合实践相结合，根据植物组织培养的技术环节多而且各项技术间关系密切的特点，随着课程教学的进展，一个接一个，一环套一环，有序进行，使每个学生牢固掌握每项基本操作，练好基本功。在进行单项技术操作训练之后，安排综合实习。要求每个学生针对某一植物的特点，从培养基配制，到外植体的选取、消毒、接种、培养、试管苗的驯化与移栽等全过程进行实践，并进行最后的实践成果展览，达到完整掌握植物组织培养基本技能的目的。建设设备完善、功能较好的校内外生产实践基地（校外为浙江传化生物技术有限公司），配备具有丰富实践经验的指导教师，聘请浙江传化生物技术有限公司具有实践经验的专业人员担任部分教学工作和实训指导。学生实训的成品要达到合格商品的要求，能产生利润。使学生充分理解植物的应用及创造性，同时也培养了学生的成就意识。
四、项目化教学改革后教学效果显著提高
在项目化课程教学实施过程中，教学效果的评价主要应关注学生。[4]项目化教学改革后，先后在杭州职业技术学院园艺技术专业2010、2011、2012级进行教学实践，结果证明，教学效果明显优于改革前。通过项目化教学改革，将课堂与企业实践操作结合，课堂建立在实训中心和企业生产车间，让学生在操作中享受成品产生利润的快乐；与浙江传化生物技术有限公司紧密联系，该企业优势明显，是全国园艺行业的龙头企业，吸收他们的新品种、新工艺、园艺行业新的生产流程，拓展了学生的知识面；课程考核与产品相结合，将学生的产品作为考核关键内容，增强了学生的责任感；课程教学改革由校企双方指导老师共同参与，双方老师共同授课，随时根据生产一线实际需求调整授课内容，激发了学生的学习兴趣。
作者简介：郑慧俊（1980―），男，浙江省杭州市，杭州职业技术学院，讲师，园艺技术专业教师。
摘要：控制污染是植物组培苗工厂化生产中重要的技术环节。该文主要污染的原因、外植体的选取与消毒、组织培养过程中各环节操作等方面，讨论了减少污染的措施和方法。
关键词：植物组织培养 污染 防治
0 引言
植物组织培养又称植物克隆，指通过无菌操作把植物的外植体接种于人工配制的培养基上，在人工控制环境下进行离体培养的一套技术。植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，在市场竞争中，如何降低成本是提高经济效益的首要问题，组织培养中污染率的增加势必引起组培苗成本的提高，经济损失很大。因此，组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。植物组织培养过程中造成污染的原因是多方面的，应根据具体情况从不同方面预防解决。
1 污染的原因
污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。在培养过程中污染是经常发生的。污染的原因，从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类。真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接种后3-10d可在培养基中发现各种颜色的菌斑。真菌性污染，一般多由接种室内的空气不洁净、超净工作台的过滤效果不理想、操作不慎等原因引起。细菌性污染的主要症状是材料附近出现黏液状物，或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在接种后1-2 d即可发现。细菌性污染除外植体带菌或培养基灭菌不彻底外，主要是操作人员的不慎造成。除要求操作人员严格按照无菌操作程序操作外，外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关。[1]
2 污染的预防措施
2.1 外植体
2.1.1 外植体的选取
外植体的选取和预处理首先应控制外植体采摘的季节、时间和部位。外植体一般在材料休眠末期或萌动前期取材较为有利，因为此时材料积累了较丰富的营养和内源激素，其抵抗病菌的能力较强、同时病菌也还未活跃起来。其次应选取无病毒的外植体，如外植体带有病毒，则应采取预栽管理、促发新枝、黄化处理、热击处理、添加抗生素等措施进行处理，以培养出无病毒的外植体。
2.1.2 外植体的消毒
外植体的灭菌处理外植体采摘后，通过表面灭菌、深灭菌或其他处理去除所带病菌，这也是接种前的重要工作。外植体消毒常用的药剂有：70-75% 的乙醇溶液，0.1%-0.2%的升汞溶液、漂白粉的饱和溶液。（1）表面灭菌。先将采摘外植体洗去泥土，用洗洁剂浸泡、冲洗，必要时用软刷或脱脂棉球擦洗材料表面，然后将其剪成适宜大小，再进行深灭菌。（2）深灭菌。经过表面灭菌后，仍有杂菌存在于外植体表面或内部，必须经过深灭菌处理才能获得不带菌的外植体，如添加消毒剂或抗生素、使用混合消毒液、水浴、灼烧、真空减压灭菌、磁力搅拌灭菌、超声波振动灭菌以及多次消毒等。但值得一提的是，目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。
2.2 组织培养过程中各环节操作
造成这类污染的主要原因有：环境条件不洁；操作人员不遵守操作规程自身带菌；操作人员操作不规范，超净工作台的过滤装置能力欠佳等。
2.2.1 改善环境条件
接种室与培养室要定期消毒与净化，接种前工作台或接种箱要开紫外灯30min以上。培养室的相对湿度应控制在7O%左右，湿度太高时可用抽湿机除湿。在接种结束时，也应清洁接种室的地面，相对湿度太高时可以用抽湿机除湿，并定期用甲醛熏蒸。[2]
2.2.2 操作人员应严格执行实验操作
穿戴专用的无菌鞋、工作服、工作帽、口罩及发罩，用消毒液洗手；接种过程中不应频繁开启接种室门窗；定期打扫或用甲醛熏蒸培养室和接种室，检查超净工作台的卫生质量：及时处理被污染的培养瓶，而不应随意弃置，以防病菌传播。
2.2.3 添加抗生素
植物体中的内生细菌潜伏得较深，表面消毒无法将其消除，这种污染在外植体的初期培养中（前几代的继代培养），不易被肉眼察觉，随着继代次数增加，菌量逐渐累积发展，才在培养基上显现出来。一旦发现培养基被污染应立即剔除，并对接种室和培养室进行紫外灯照射或药液熏蒸。但是，在使用抗生素时必须弄清抑制的病菌种类、使用的抗生素是否对培养的植物组织有不良影响以及抗生素的使用浓度和处理时间。由于能对所有微生物都有效的抗生素是不存在的，因此抗生素也不能完全代替灭菌技术，而最好的方法就是将其添加在培养基中作为防止污染的辅助措施。
2.2.4 其他
对接种材料要严格把关，淘汰被污染的接种材料；检查灭菌锅的质量，如严格执行实验操作后仍有污染现象，则应及时检查灭菌锅的性能；检查培养容器是否存在污染问题，培养容器大多用塑料盖、胶塞、棉塞或薄膜等封口，其中塑料盖使用太久后易老化、密封性较差，也会造成污染。培养瓶要充分洗净并消毒，灭菌后不应放在空气中太长时间，一般于灭菌后1-2d接种为宜，以减少污染。
3 展望
在植物组培苗的工厂化生产过程中，由于污染造成生产成本偏高或产品不合格的情况时有发生，严重影响了组培苗的工厂化生产进程，因此开展污染防治的研究显得非常迫切。通过对组培外植体的处理和严格无菌操作等措施均能够有效降低污染率，但在防治污染方面还有很多问题需进一步研究。目前，组织培养的工作不仅集中在无菌操作空间、无菌培养空间及高效抗生素的获得上，开创新的组织培养方法及培养条件也是研究的重点领域之一，总而言之，控制或降低污染率是植物组织培养的关键技术之一，同时也是组织培养工作效率高低的重要指标之一。从组织培养的全过程来看，每一环节都可能出现污染，为了实现低污染率在组织培养中除了加强无菌意识，提高无菌操作各环节的技术规程外，还要注重无菌操作训练，提高操作水平，同时在培养基中针对性的加入抑菌剂、抗菌素。[3]
摘要 以植物组织培养技术实验课为例，从教学内容设计、考核方式等细节进行创新，通过分析改革效果，表明创新该课程可调动学生学习的积极性，增强其意志品质，同时还分析了改革的不足之处及下一步对策。
关键词 植物组织培养技术；教学；考核；创新
植物组织培养技术的发展已有100多年的历史，该项技术的诞生、发展也催生了生物技术的快速发展[1]。
安徽科技学院是安徽省首批应用型本科示范性建设高校，大力提高本科教学质量、培养创新创业人才是学校的根本任务和目标。根据《植物组织培养技术》实验课程实践性强、与理论结合紧密的特点，2010年对2008级农艺教育专业2个班共77名学生开展了对该门课程教学模式、考核方法改革创新的尝试，同学期的89名同学仍然以讲授、操作验证性实验项目为参照，探索改革创新的优点与不足，为进一步改革创新提供思路。
1 设计与实施研究性教学内容
研究性教学的特征之一是教学内容的综合性[2-3]。以《植物组织培养技术》实验课为例，对比研究性实验项目和验证性实验项目可知，前4个项目是需要学生掌握的是基本实验操作技术，即要求学生了解移液器、高温消毒器、电子天平及刀剪镊灭菌器等组培常用仪器的使用方法，明确最常用的MS基本培养基母液及常用的激素的用途、配制方法及使用浓度，通过掌握1个最常见的培养基配方的配制及灭菌操作，同时结合掌握外植体灭菌及无菌操作，了解植物组织培养一整套的基本操作程序（表1）。
下一步实施中，将77名学生分为16组，每组4～5人，在4位经验丰富的实验教师指导下，查询国内外相关资料，由学生自主选择植物，按照3条技术路线的1条具体实施（图1）。
2 创新考核方式
对进行研究性实验的2008级农艺教育专业2个班，重新制定了学生实验成绩的评定方法。一是增加了随堂考核环节。为了让学生牢固掌握组培的基础环节，在讲解完《培养基配制与灭菌》章节的内容后，立即给各小组发放1张有不同配方的纸条，要求各小组在10 min内完成配方内各类元素及激素、琼脂、蔗糖的计算，错误的组别扣除一定的平时分，并要求其重新计算直到正确为止。二是将平时的观察次数列入考核项目。由于《植物组织培养技术》实验内容涉及到植物在离体条件下生长的各环节，需要多观察、多分析，故设定该环节，亦是为了让学生能及时掌握质量性状（颜色、是否污染等）和数量性状（增殖苗数、生根数等）的统计方法、锻炼其试验的认真态度，通过对不同现象的分析和探索，加强师生之间的交流。三是整体和个体相结合的全面考核环节。除了有实验报告和总结之外，为了更好地了解每个学生参与实验情况，在学期结束时首先安排各组组长全面总结、陈述该组实验的设计、遇到的问题、解决的方法以及实验结果，进而由教师对每位同学就实验中的问题进行随机提问，视学生对实验的熟悉程度、回答问题情况进行综合评判，给出实验成绩，每组由2位老师把关，取其分数进行平均，即得出该同学的最终实验成绩（表2）。
3 创新效果评价
鉴于实验评分的人为性及2种教学方式的巨大差异性，从真正掌握理论知识和实验操作角度考虑，以不同年份、不同班级的同一份期末试卷为标准，期望通过纵向和横向对比，用卷面成绩反映出2种教学方式的差异。
由表3可知，进行纵向比较，3年中成绩以2010年的平均成绩最高，达80.30分，优秀比率最多，达20.51%，不及格率最低，为3.21%，个人最高成绩出现在2009年，最低成绩出现在2011年。对2010年进行横向比较，开展研究性教学班级的平均分为80.60分，而验证性实验的班级仅为80.07分，说明2010年的总体80.30分的平均分的贡献主要来源于开展研究性实验的班级，且其不及格率仅为2.99%，但其优秀人数要低于验证性实验班级。说明经过学生主动学习、探索的过程，有助于学生更加熟练掌握组培的流程，清楚理论课上的定义、步骤在具体实验中的重现以及各项操作的注意事项、每个步骤的意义，但同时由于每组仅实施3种不同技术路线的1个，忽视了其他2条路径特定环节的操作细节，因而出现了平均成绩较高但成绩优秀的学生比例不多的现象。
4 结语
研究性教学是让学生在独立的探索、思考和实践的研究过程中吸收知识、应用知识、分析问题和解决问题[4]。其改革的目的是强调学生由被动学习到主动探索、思考、实践的过程，因而具有更高的挑战性。从现场考核、实验操作、卷面成绩等方面都反映出新的实验课教学方法所产生出的可喜效果。一是调动了学习的积极性，提高了学生动手能力及团队意识。研究性教学所涉及的实验路线是一个完整的组培过程，学生在具体实施前会查询国内外资料，自我设计配方并配制，定期观察结果、分析并解决问题。经过上述锻炼，组内学生之间会加强相互沟通，从自身的认知度来阐述出现问题的原因及解决的途径，调动了学习的积极性，提高了自身动手能力和团队合作意识。二是增强学生的意志品质，加强师生交流。对首次接触《植物组织培养技术》实验课程的学生来说，其难点集中于外植体污染、合适培养基和激素配方的筛选、炼苗等环节。多数组别在解决外植体污染问题时至少要经过2～3次的实验，对学生的意志品质有了更高的要求，且通过在解决问题时主动与指导教师及时沟通，加强了师生之间的交流，明晰问题出现的原因、解决途径并进行总结。因而，在此过程中，指导教师不再是单纯的知识传授者，而是学生学习的引领者、参与者和学习顾问。
另外，实验课程教学的创新中也反映出一些问题，一是时间设置较短。基于植物生长规律，近2/3组别只完成了实验路线中1/2，仅有2组完成了全部内容环节。二是部分同学存在“搭便车”现象[5]。通过实验考核环节，发现少数同学不能回答本组实验中出现的问题，甚至个别同学无法说出培养基和激素配制的步骤，反映其只是挂名，参与度较低、责任心较差。三是考核环节需细化。此次考核系通过2位老师随机提问来了解学生对实验的掌握程度，并未细化学生对实验操作、配方配制、国内外研究进展的了解。上述问题可以分别通过选择组培周期短的植物、延长实验时间、平时加强与每一位参与学生的交流及根据重要性给各考核环节分别赋分的方式予以解决，同时这也对指导教师提出了更高的要求，即及时更新和拓宽知识面、不断提高科研水平。
一、考情分析
植物组织培养在农业生产中的应用、动物细胞培养的过程及影响因素一直是高考命题的热点。命题会利用信息材料为背景以图解的形式考查有关植物组织培养的相关知识，或结合植物育种、动物细胞培养等知识进行综合考查。
二、复习建议
本部分题目中常出现操作流程图或装置图，如植物组织培养的操作流程图、动物细胞培养过程图等，复习过程中要注意运用列表比较的方法分析不同技术手段的异同点，注意掌握各种技术手段中的特殊点和关键环节；要善于识别这些图解，要知道图中所表示的物质、结构和过程，知道每个环节的操作要点，并对一些现象进行正确分析。
三、知识梳理
（一）植物组织培养
1.原理：植物细胞具有全能性。
2.过程。
3.植物组织培养过程的几点说明。
（1）外植体的选择与制备。
①选择外植体时，由于外植体的脱分化难易因植物种类、器官来源及生理状况的不同而有很大差异，因此，选择哪些作为外植体应注意。一般来讲，烟草、胡萝卜、植物的花和幼嫩的组织脱分化相对较易，而植物的茎、叶和成熟的老组织则较难。
②制备外植体首先要消毒，其次要选取有形成层（形成层细胞易脱分化）的部分。
（2）严格的无菌条件。
植物组织培养用的培养基含有植物生长发育所需要的各种营养物质，这些营养物质同样为细菌等微小的生物提供了适合的营养。在这种培养基上，细菌等微小的生物比植物细胞具有更强的新陈代谢能力，它们比植物细胞生长、繁殖得更快，而且它们会产生毒素，使培养的植物细胞很快中毒死亡。因此，植物组织培养要想取得成功，必须有效地防止细菌等的污染，保证培养材料、培养基、培养用具严格无菌。
（3）完全的营养条件。
离体的植物细胞失去了植物的自养能力，所以需要为其提供包括水、有机营养、矿质营养、维生素等营养物质。
（4）光照条件。
离体的植物细胞、组织和器官脱分化形成愈伤组织时，需避光处理；而愈伤组织再分化形成植物幼苗时，需光照处理。
（5）激素调控。
①生长素类含量＞细胞分裂素类含量：诱导植物组织脱分化和根原基形成。
②生长素类含量＜细胞分裂素类含量：诱导愈伤组织再分化和芽原基形成。
③赤霉素类：促进分化的丛芽和小植株快速生长。
【易混警示】分化、脱分化、再分化。
比较内容脱分化再分化分化过程外植体愈伤组织愈伤组织幼苗形成体
特点排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞有根、芽需要条件a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例适中；d.不需光a.离体；b.适宜的营养；c.生长素/细胞分裂素的比例高（或低）诱导生根（或生芽）；d.光照在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构和生理功能上发生差异的过程，具有普遍性、持久性、稳定性和不可逆性；分化的结果是形成不同的组织器官，帮助个体完成正常的生长发育4.植物组织培养技术的应用。
（1）植物繁殖的新途径。
①微型繁殖。
实质植物组织培养原理植物细胞的全能性条件培养基中加入细胞生命活动所需的水、矿质元素和小分子有机物，还有激素，更重要的是所有加入的物质必须是无菌的，操作过程必须是在无菌条件下操作，这样繁殖的幼苗才是无毒的微型繁殖
技术的
优点a.能保持亲本的一切优良性状，子代个体具有的遗传物质与亲本一样
b.选材少，培养周期短，繁殖率高
c.不受自然生长季节的限制，便于自动化管理，有利于进行工厂化培养范围作物脱毒，人工种子中的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽的获得采用的技术均是微型繁殖②作物脱毒：a.解决方法：切取一定大小的茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。b.理论基础：植物分生区附近病毒极少，甚至无病毒。c.特点：繁殖速度快；幼苗遗传背景均一；不受季节和地区限制。
③人工种子（如下图）。
人工种子主要由三部分组成:
a.胚状体(分生组织),它相当于天然种子的胚,是有生命的物质结构；
b.供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的“人工胚乳”；
c.具有保护作用的“人工种皮”。
【特别提醒】人工种皮是保证包裹在其中的胚状体顺利生长发育成小植株的关键部分，针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。
（2）作物新品种的培育。
①单倍体育种：花药离体培养过程就是植物组织培养过程。
a.原理：整个单倍体育种过程的原理是染色体变异，其中的花药离体培养是利用细胞的全能性。
b.过程：通过花药离体培养获得单倍体植株，染色体加倍后当年可得到稳定遗传的优良品种，极大地缩短了育种年限。如下图：
花药离体培养单倍体幼苗种水仙素诱导染色体数目加倍纯合子
②突变体的利用。
a.来源：植物组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断分生状态，容易受到培养条件和外界压力的影响而产生突变，从这些突变的个体中可以筛选出对人们有用的个体，培育新品种。如下图：
b.实质：植物组织培养。
c.形成原因:培养细胞一直处于不断分生的状态，容易受外界一些条件的影响而发生突变。
③细胞产物的工厂化生产：可以利用植物组织培养技术大量生产某些细胞产物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。
【易混警示】单倍体育种和突变体利用的比较。
项目原理优点成果单倍体
育种染色体变异明显缩短育种年限单育1号烟草品种，11号水稻和京花1号小麦品种等突变体
利用基因突变产生新基因，大幅度改良某些性状抗花叶病毒的甘蔗；抗盐碱的野生烟草等（二）动物细胞培养
1．概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
2．操作流程。
3.过程解读。
（1）原理：细胞增殖。
(2)动物细胞培养的条件。
①充足的营养供给――微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。
②适宜的温度、适宜的pH。
③气体环境：O2、CO2。
④无菌、无毒环境培养液和培养用具杀菌消毒
培养过程加抗生素杀菌
定期更换培养液，清除代谢产物
（3）动物细胞要分散成单个细胞培养的原因：分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。
（4）选取幼龄动物的组织、器官作为材料的原因：动物细胞培养时，一般选取幼龄动物的组织、器官，其细胞的分化程度较低,增殖能力强,有丝分裂旺盛，容易培养。
（5）胰蛋白酶在培养过程中的作用及与原代培养和传代培养的联系。
原代培养和传代培养一般均需对细胞进行胰蛋白酶细胞分散处理，区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象。
①第一次：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，分散后培养，即为原代培养。
②第二次：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，分散到多个培养瓶中继续培养，即为传代培养。
（6）细胞贴壁和接触抑制。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
4.植物组织培养与动物细胞培养的比较。
比较项目植物组织培养动物细胞培养培养基的物
理性质固体培养基液体培养基(合成培养基)原理细胞的全能性细胞的增殖培养的成分水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果新的植株或组织新的细胞系或细胞株目的①苗木的快速繁殖；②培养无病毒植株；③生产药物、香料等；④制备人工种子；⑤单倍体育种获得细胞或细胞的产物（如单克隆抗体）取材植物细嫩的部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织其他条件均为无菌操作，需要适宜的温度、pH、O2等条件【特别提醒】①两种技术手段培养过程中都进行了有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂。
②植物组织培养最终产生新个体，体现了细胞的全能性；动物细胞培养产生大量细胞，不形成新个体，故不能体现细胞的全能性。
【易混警示】原代培养和传代培养的辨析。
原代培养传代培养可有两种表述：a.细胞悬液第一次在瓶中培养，没有分瓶培养之前的细胞培养；b.第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养同样有两种表述：a.细胞悬液培养一段时间后，分瓶再进行的细胞培养；b.传10代以后的细胞培养四、典例展示
例1.通过植物组织培养技术可以快速繁殖、生产药物及培育无病毒的植物等。据图甲、表乙回答问题。
离体的植物器官、组织或细胞①愈伤组织②胚状体培养植物体
图甲植物组织培养过程
表乙：植物的花芽分别在含有不同比例的生长素和细胞分裂素的培养基中的生长状况
A组B组C组D组E组生长素03ppm3ppm0.03ppm0细胞分裂素00.2ppm0.002ppm1.0ppm0.2ppm花芽生
长状况仍是组
织切块形成愈
伤组织愈伤组织
分化出根愈伤组织分
化出嫩芽稍生长(1)离体的植物器官、组织或细胞能够被培养成新的植物体的原因是。
(2)用植物组织培养方法诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状体结构，若包裹上人造种皮，制成人工种子，可能解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是图甲中［］和［］过程，在此过程中被培养的细胞始终受的调节(［］内填序号)。
(3)应用植物组织培养技术培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株，其原因是。
(4)从表乙的实验结果可看出：生长素和细胞分裂素是实验中的两种重要物质。其中，新芽形成必需的条件是；而在培养形成完整新个体过程中，对它们的调控关键是。
解析：(1)植物组织培养的原理是细胞的全能性。(2)①是脱分化，得到愈伤组织，②是再分化，得到胚状体。(3)植物的根尖或茎尖分裂快，病毒尚未来得及侵染。培养茎尖或根尖组织可获得无病毒植株。(4)由表乙D组看出，细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度，脱分化出嫩芽。在不同培养期，细胞分裂素与生长素的浓度和比例不同，分化的器官就不同，在组织培养过程中，其浓度和比例非常关键。
答案：(1)植物细胞的全能性(2)①脱分化②再分化植物激素(3)植物的茎尖或根尖很少被病毒感染，甚至无病毒(4)细胞分裂素的浓度大于生长素的浓度适当调控好不同培养期的培养基中细胞分裂素与生长素的浓度和它们的比例
例2.（2014・甘肃秦安一中第一次检测卷）某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行细胞培养。下列说法不正确的是（）
A．在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理
B．为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的抗生素
C．细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是维持培养液的pH
D．将数量相等的甲、乙细胞分别置于相同适宜条件下培养，一段时间后，会观察到甲细胞的数量比乙细胞的数量多
解析：胃蛋白酶最适pH是1.5，而一般细胞培养在pH是6.5~8.0，所以不能用胃蛋白酶处理，A项错误。抗生素可以有效抑制细菌的繁殖，所以可以加入适量抗生素，B项正确。细胞培养过程中，5%CO2的作用是调节细胞培养液的pH值，故C项正确。因为肝肿瘤细胞在适宜条件下具有无限增殖的能力，而普通细胞没有此特性，所以D项正确。
答案：A
例3.回答下列有关动物细胞培养的问题。
(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的。此时，瓶壁上形成的细胞层数是。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是。
(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成细胞，该种细胞的黏着性，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量。
(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不被染色，原因是。
(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选细胞分裂到期的细胞用显微镜进行观察。
(5)在细胞培养过程中，通常在条件下保存细胞。
解析：（1）在动物细胞培养过程中，细胞会表现出接触抑制现象，此时是单层细胞。用胰蛋白酶可以使贴壁细胞从瓶壁上分离开来。（2）随着细胞传代培养代数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象，但极少数细胞可以连续增殖，有些细胞会因遗传物质改变而变成不死性细胞。（3）由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，而死细胞的细胞膜丧失选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色。（4）由于细胞分裂中期染色体形态固定、数目清晰，因此可作为显微镜观察染色体数目的最佳时期。（5）冷冻或超低温、液氮条件下，细胞中酶的活性降低，细胞新陈代谢的速率降低，故适宜保存细胞。
答案：(1)相互接触接触抑制单层(或一层)胰蛋白酶(2)衰老甚至死亡不死性（大大）降低减少(3)由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不被染色(或由于死细胞的细胞膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内)(4)中(5)冷冻(或超低温、液氮)
五、巩固训练
1.（2013・北京市东城区期末卷）右图表示一定条件下将胡萝卜的离体组织培育形成试管苗的过程。下列有关叙述不正确的是（）
A．需在无菌条件下将离体组织接种到培养基中
B．图中①②过程分别表示脱分化和再分化
C．利用此过程获得的试管苗均为纯合子
D．此实验说明分化的植物细胞仍具有全部的遗传信息
2.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导的植物激素分别是（）
①体细胞全能性②离体植物器官、组织或细胞③根、芽④生长素和细胞分裂素⑤生长素和乙烯⑥愈伤组织⑦再分化⑧脱分化⑨植物体
A．①、②⑦⑥⑧③⑨、④
B．①、②⑧⑥⑦③⑨、④
C．①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤
D．①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤
3.下列关于动物细胞培养的叙述中，错误的是（）
A．用于培养的细胞多取自动物胚胎或幼龄动物
B．培养过程中需要使用胰蛋白酶等获得细胞悬液
C．动物细胞培养时要保证氧气供应，不能通二氧化碳
D．动物细胞培养时的培养基是液体培养基，并要加入血清
4.下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）
A.动物细胞培养需要无菌、营养、适宜的温度和pH等条件
B.用胰蛋白酶作用于离体的动物组织，使其分散成单个细胞
C.放入CO2培养箱中培养动物细胞的主要目的是为了满足细胞对CO2的需求
D.细胞株一般具有恒定的染色体组型、生化特性等
5.（2013・吉林省吉林一中高三第二次摸底考试卷）植物组织培养是克隆植物的一种方法，过程如下图所示，请回答相应的问题。
(1)为了获得脱毒植株，外植体往往取自植物的花芽、叶芽等处的分生组织，其原因是。
(2)培养皿中的培养基除添加营养物质外，还需要添加植物激素，其目的是诱导外植体。
(3)在生产实践中为获得大量的细胞产物，如紫杉醇，可将①放入液体培养基中，经机械作用分散成单个细胞，制备成细胞浮液，再经过即可获得大量细胞。
(4)组织培养过程需要植物生长和繁殖的最适条件，否则在光学显微镜下可能观察到发生异常，进而使植物出现遗传不稳定甚至不育。
(5)植物组织培养技术不仅应用于花卉和果树的快速大量繁殖以及脱毒植株的获取，还广泛用于、、等育种过程中。
6.制造人工种子的原理是在组织培养得到的“胚状体”的最外面用一层有机膜包裹，并在薄膜以内放入一些营养物质，这层膜和这些营养物质分别具有种皮和胚乳的功能（如下图所示）。在制造过程中还可以加入某些农药、菌肥等。据此材料回答下列问题：
（1）胚状体来源于离体的植物体细胞，其形成过程中要经过的生理变化大体上是和。在这一过程中被培养的细胞始终受的调节。
（2）从保证人造种子正常生命力及生态系统物质循环上来看，其外部薄膜应具有等的特点。
7.（2013・福建福州期中卷）下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：
（1）容器A取材于动物胚胎或幼龄动物的原因是。
（2）容器B中一般先用酶处理，消化组织中的胶原纤维，这利用了酶的性，这样做是为了使细胞分散开来，便于细胞与充分接触。
（3）C瓶内的培养为，这一时期的细胞具有恒定的、和生化特性等。
（4）为了把C瓶中的细胞分散到D瓶中，用处理，然后配制成，再分装。
（5）在D瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是。
参考答案
1.C2.B3.C4.C
5.（1）这些部位很少受到病毒等病原体的侵害
（2）脱分化和再分化
（3）愈伤组织细胞分裂
（4）染色体结构和数目
（5）植物体细胞杂交育种基因工程育种单倍体育种
6.（1）脱分化再分化植物激素
（2）半透性（透水、透气性）和能被微生物降解
7.（1）细胞分裂旺盛
（2）胰蛋白专一培养液
（3）原代培养染色体组型病毒敏感性
（4）胰蛋白酶细胞悬浮液
（5）细胞没有发生癌变
摘要： 《植物组织培养》是生物专业的必修课，也是一门系统性、实践性很强的课程。为提高学生的实践技能，培养创新型人才，本文从优化教学内容，改革教学手段，加强实验考核，全面评价学生能力等方面进行了讨论。
关键词： 《植物组织培养》 理论教学改革 实验教学改革
植物组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。植物组织培养技术几十年来得到迅速发展，已渗透到生物学科的各个领域，成为生物工程技术中一个重要的组成部分和基本研究手段之一[1]，目前这项技术已广泛应用于生产中，如利用单倍体育种，胚培养，体细胞杂交等技术来培育植物新品种，对无性繁殖植物进行脱毒，快速繁殖苗木，生产次生代谢物质，保存种质资源等[2]。《植物组织培养》是生物学专业的必修课，同时也是一门理论性、实践性很强的课程，通过课程学习，使学生掌握组织培养的基本原理和基本技术，为以后从事基础研究、苗木生产等工作奠定基础。面向21世纪知识经济时代，应树立知识、能力、素质并重的观念，由只重视知识传授向融传授知识、培养能力和提高素质为一体转变，突出素质教育和创造型人才的培养[3-4]。因此，在新形势下进行课程改革，提高学生的理论水平和实践操作技能迫在眉睫。
1.理论教学改革
《植物组织培养》课程内容很多，近几年来，理论教学的学时数不断缩减。为此需要优化教学内容，讲授基本理论和基础知识，把内容精简成四个教学模块。一是实验室和仪器设备，主要介绍实验室的布局安排、所需的主要工具及仪器设备，安排在实验室里进行现场教学，既少用学时又利于学生理解，加深印象。二是培养基选择和制备，使学生明确各种药品的作用和培养基的配置方法。三是器官培养，以根尖、茎尖、叶片、花瓣等器官为主要材料，讲授外植体选择和消毒处理方法，无菌接种技术，培养产物的统计方法。四是组织培养的应用，主要讲授脱毒技术，离体快繁技术，花药培养技术等。后三个模块主要采用多媒体进行讲授。在讲授中，重点讲解原理和技术，理论联系实际，注重实用性。充分发挥多媒体教学的优势，用丰富的图片、视频等进行形象说明。如在讲解接种时，把步骤分解成几个图片，同时附上错误步骤的图片，这样清晰明了。并且避免一味“满堂灌”，运用多种教学手段，适时采用对比、总结、讨论等方式，如总结各种培养基的特点，对比各种消毒剂的效果，讨论各种外植体的消毒方法、接种方式，也安排一定的章节由学生自学或学生讲解，如室内培养和幼苗移栽环节。总之要充分发挥学生主体，教师主导的作用，调动和激发学生的积极性和兴趣，启发学生思考，变被动学习为主动学习。通过四个模块的教学就使学生对整个组织培养有了系统的理解，为今后从事相关工作奠定了坚实的基础。
2.实验教学改革
2.1教学内容改革
学生实验是《植物组织培养》课程的重要教学部分，其目的是使学生巩固和加深所学理论知识，培养学生观察、分析、解决问题的能力，严谨、求实的作风。恰当安排实验内容是提高学生实践动手能力、科学实验能力的关键所在。开设实验室的布局和仪器购置实验，使学生能合理安排实验用房熟练操作常用的接种、灭菌、培养的仪器设备。以4人小组为单位，开设培养基母液和培养基配置及灭菌实验，要求小组能熟练进行药品的称量，倍数换算，灭菌。最后小组内交流经验，达到人人胜任的要求。开设接种实验，学生在接种后标记姓名，统计污染率，锻炼学生的无菌操作能力，要求人人过关。以上实验属于基础技能培养。我们还开设能力提升实验，以4人或8人小组为单位，开设2种植物的离体培养实验。具体做法是小组成员确定培养材料，学生可自由选择植物的叶片、花瓣、种子等材料，查阅资料确定具体培养方案，包括设计培养基类型，消毒剂种类和消毒时间，和指导教师商讨后开始实施。教师全程跟踪，指导学生操作。本实验提高了学生兴趣，培养了学生大胆动手、改革创新的能力，也锻炼了学生的设计能力，同时这也是一个综合性实验，锻炼了学生外植体消毒、无菌接种、培养等多种技能。
2.2实验考核改革
对实验进行考核是评价学生实验能力的方法，也是督促学生学习的手段之一。要求学生在课前预习实验的内容，理解操作步骤，并写出报告，做到心中有数，达到事半功倍的效果。教师根据学生的理解程度打分。在实验中，要求学生能认真操作，相互配合，并逐一对学生的操作水平和熟练程度进行打分，对于分数低的学生重点指导，督促其练习。要求在课下及时整理实验内容书写实验报告，重点写明实验的过程，尤其是实验的关键环节，并着重分析实验结果，提出改进意见。这种考核方式注重了学生的基础实验知识，操作技能，设计能力，尤其是学生的动手能力和解决问题的能力，完全改变了过去只注重实验报告尤其是实验结果的考核方式。在学期末还要进行实验考试，重点是考查学生的药品配置、无菌操作等基本技能。实验成绩分数低的学生需重新实践，合格后才能参加期末理论考试。这一系列的措施使学生在课前进行预习，上课认真操作，课下及时总结实验结果，增强了实验课的教学效果，提高了学生实验技能，培养了学生的创新能力。
组织培养技术发展迅速，教师要不断探讨新的教学方法才能提高教学质量，培养学生的创新能力，适应社会发展的需要。
购物车(0)