【关键词】中药复方制剂 研发 程序
前言：中药是中华民族医药瑰宝，有数千年临床经验，在人类健康和疾病治疗中具有重要作用，其研究和应用目前在国际上处于领先地位。中药作为绿色药物，与西药相比，因副作用较少；再加上国家对中药发展的重视和国际上日益增加的对植物药的需求，中药的应用已越来越引起人们重视。目前市场上对中药的需求日益增多，市场对新药开发的要求也越来越高[1-2]。兹根据2007年10月1日起施行的《药品注册管理办法》、《中药、天然药物注册分类及申报资料要求》等政策法规对中药复方制剂研发程序做一简介。
1 中药复方制剂研发有6个程序
1.1.中药复方制剂新药的选题
中药复方制剂研发目的是创制新药、促进中药学科发展，增进人类健康。选题时必须坚持科学性、创新性、可行性、效益性的指导原则[3-4]。中药复方制剂新药的选题主要来源于传统古方、民间验方（包括祖传秘方）、名医验方、医院制剂协定、法定处方等，皆以确凿的临床治疗效果为选择准则。对药物治疗效果的确定，可以说是整个新药开发工作的基础、也是意义最重大的工作，药物治疗效果的优良与否标志着新药选题起点的高低[5]。
药物有效性、安全性提高了，中药复方制剂新药研发的水平也就提高了。但是有效性、安全性的提高是一个多因素影响的结果，与具体药物的组成有关，也与药物剂型有关。剂型的选择直接影响到药物生物利用度的高低，影响到体内血药浓度的水平，与药物疗效息息相关，中药复方制剂新药的研发一定要跟上剂型发展的步伐，通过最佳剂型的应用来提高药物有效性、安全性。如在中药治疗肝病的研究中，有研究者对靶向制剂脂质体包埋物进行了研究，结果表明有效性、安全性优于普通剂型。此阶段需完成综述资料：1#∼4#资料项目。注意：其中4#资料项目申请新药临床试验时，需要结合药学研究、药理毒理研究来完成该资料项目的整理总结；完成临床试验后申请新药生产时，需要结合药学研究、药理毒理研究及临床研究结果来完成4#资料项目的整理总结 [6-8]。
1.2.进行制备工艺、质量标准等药学研究
设计合理的先进的制剂工艺关系到有效成分的提取、利用、制剂的有效性、安全性、稳定性、适用性和经济效益。制剂工艺的研究应当以成分分析为基础，整体药物效应为导向，尽可能应用新工艺、新技术、新辅料、新设备，对制剂研究全过程进行跟踪监控，优选最佳工艺、研究新制剂、发展新剂型[2-4]。同时要进行产品质量标准的研究。并结合制备工艺、质量标准等药学研究结果完成药学研究资料：7#～8#资料项目、12#～18#资料项目的整理总结。如产品配方中含有法定标准外的中药材、天然药物的还必须提供下列药学研究资料：9#～11#资料项目的整理总结[6-7]。
1.3.完成药理、毒理学研究
在进行并完成制备工艺研究、质量标准研究等药学研究后，即可进入药理毒理学研究程序；需要注意的是这一部分的所有工作都必须使用药学研究期间所取得的同一批号的中试产品来进行。在这一阶段，各项工作可以同时展开。并需要根据药理毒理学研究结果完成：19#资料项目、20#资料项目、21#资料项目、22#资料项目、23#资料项目的整理总结。需要指出4种申报项目情况需要提供：24#资料项目、25#资料项目、26#资料项目、27#资料项目的整理总结。此4种具体情况请参照2007年10月1日起施行的《中药、天然药物注册分类及申报资料要求》（即国家食品药品监督管理局局令第28号附件1）的申报资料项目说明（7）～（10）的指导原则进行相关研究和资料项目的整理总结 [6-7，10]。 转贴于
1.4.申请临床研究前的资料准备
申请新药临床试验，一般应报送：1#～4#资料项目、7#～8#资料项目、12#～23#资料项目、29#～31#资料项目；其中9#～11#资料项目、24#～27#资料项目根据法规要求的具体情况确定是做出情况说明还是整理资料申报。28#资料项目，动物药代动力学试验资料及文献资料，根据法规要求可以免报。
在完成以上程序1.1.～1.3.研究工作的同时完成临床试验资料的准备，即完成29#～31#资料项目的总结整理。待完成相关资料项目后，即可向所在省级食品药品监督管理局药品注册司提出申请，通过省级初评后报送国家食品药品监督管理局申请临床研究[6-7，10-11]。
1.5.完成II、III期临床研究
通过评审获得临床研究批文后，即可在有资质的临床研究基地进行多中心，试验组不少于100例的II期临床研究，药物对目标适应症患者的治疗作用初步评价和安全性研究，也包括为III期临床试验研究设计和给药剂量方案的确定提供依据。此阶段的研究设计可以根据具体的研究目的，采用多种形式，包括随机盲对照临床试验。完成I I期临床试验后需再申请进行扩大的多中心随机盲法对照的III期临床研究。试验组不少于300例，主要通过扩大临床试验、特殊临床试验、补充临床试验、补充临床试验、不良反应观察，评价利益与风险关系，为药物注册申请的审查提供充分的依据[6-10]。
1.6.申请新药证书及药品注册批件
完成I I、I I I期临床试验后申请新药生产，一般应报送：1#～8#资料项目、12#～23#资料项目、29#～33#资料项目以及其他变更和补充的资料，并详细说明变更的理由和依据。其中9#～11#资料项目、24#～27#资料项目根据法规要求的具体情况确定是做出情况说明还是整理资料申报。28#资料项目，动物药代动力学试验资料及文献资料，根据法规要求可以免报。需增报：5#～6#资料项目、32#～33#资料项目。通过评审后，研究单位获得新药证书，生产单位获得药品注册批件。至此，中药复方制剂新药研发工作基本结束。但为加强安全性评价，保障人体用药安全法规还要求生产企业自主开展开放的I V期临床研究，试验组不低于2000例，以进一步考察在广泛使用下的药物疗效和不良反应，评价在普通或者特殊人群中使用的利益与风险关系以及改进给药剂量等[6-7，11]。
以上是中药复方制剂研发工作的一般程序，由于中药复方制剂来源和配方的多样性，再加上作为中药发展战略目标的中药现代化的快速推进，每一个新药具体研究过程是不完全相同的，本文所提出的程序仅供参考，具体研究时应及时与药品监督管理部门沟通，根据不同的情况合理安排进程[12-15]。
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关键词 中药新药 研究开发 现状 方法
一、现状
美国辉瑞公司生产治疗男性功能障碍的药物??"伟哥",一些乐观的预测甚至认为它年销售额能达到创纪录的110亿美元。伟哥自1998年3月获美国FDA批准以来,风靡世界,说明新药可获取几乎是无限的高额利润。即使深知一类创新药在发达国家耗时10~12年,耗资2亿美元以上,且高风险,世界各大跨国公司仍然投入其年营业额的15%~20%研究开发新药[1,2]。
中药研究开发是国际热门课题:国际市场每年药用植物及制品(包括保健品等)的交易额超过300亿美元。日本是较重视中药研究开发的国家,年销售额达1500亿日元。美国国会1994年批准了把草药列为《饮食补充剂》的法案之后,1997年又制定了"植物药在美批准法"(草案),不再要求草药产品是已知结构的单体纯品,而可以是成分固定、疗效稳定、安全可靠的复方混合制剂。德国在欧洲是传统药年销售额最大国家,达22亿美元[2]。德国Dr Schwabe生产的银杏叶提取物制剂Tebonine(促进脑血管循环)年销售额超过1亿美元,银杏叶及其制剂仅在欧洲市场年销售额就达几亿美元;德国宝灵家大药厂则是新型植化产品的主要开发者,开发喜树碱系列、莨菪胺类和育享宾等产品;其它德国公司还在开发山梗菜碱(可帮助戒烟)以及一种可用于合成抗抑郁药和抗老年痴呆症新药的中间体"槟榔碱"。在东亚国家中印度植物中开发出若干种有药用价值的新成分,胡黄连中提取的"胡黄连素",用于治疗漫性乙肝,以及来自巴戟天根的一种新型成分"bacoside",作为增智药品,用于提高人的记忆力[3]。
我国的中药新药研究开发已走上科学化、规范化、标准化和法制化的轨道。至今已有1141种中药新药通过注册,其中一类新药占11.5%,二类占6.5%,三、四类各占40%,五类占2%。反映新药研制水平的一二类新药的数量明显偏少;对于三类新药的研制也多相重复,忽视了发展创新、基础研究及科研水平的提高;研制的整体水平不高,低水平重复现象严重[4]。尽管如此,新药仍取得了很高的经济效益,占整个药品销售额10%以上,利润大约在20%以上,1997年年销售额超过1亿元的中药新药50个品种以上。从野生植物黄花蒿分离抗疟有效成分青蒿素对急性脑疟疗效较好,是新型结构的抗疟药;为提高抗疟效价,进行了大量结构改造工作,成功地研制出蒿甲醚、双氢青蒿素、青蒿烷酯等新型衍生物,此药被国际认可,引起了广泛注意。抗早孕药天花粉和男用避孕药棉酚也受到国内外重视。
中药的发展前景十分广阔,已受到世界的瞩目。中国已向美国FDA进行了首次的复方中药注册申请,并分别于1997年12月和1998年3月通过了"复方丹参滴丸"和"银杏灵"新药临床研究(IND)预审,实现了中药的历史性突破[5],随之而来将会有更多成熟的中药品种进入世界。
二、面向21世纪中药新药研究、开发的思考
1. 加强天然产物活性成分研究,从中寻找一类新药
1805年从阿片中分离出吗啡标志着单体化合物作为新药来源时期开始。近年来,从天然产物中研究开发新药,最引人瞩目的成果当算紫杉醇,1992年批准上市,作为治疗卵巢癌的首选药物。近70年来,我国先后研制出70余种高特新药广泛应用于临床,其中,两个举世公认的具有划时代意义的麻黄素和青蒿素,都是从我国常用中药发掘出来的。对天然药物进行深入的化学与生理活性的研究,从而发现临床上有用的原型药物,存在着极大的机遇,发现具有开发前景的新类型结构化合物作为先导化合物,经结构修饰和改造,寻找疗效更高、结构更为简单,并且便于大生产的、安全有效的候选化合物,再经临床验证判断这个化合物是否能成为新药而上市。据报道,现在临床用药一半来自天然产物及其衍生物。如吗啡研究发展了异喹啉类生物碱的研究,导致了镇痛药杜冷丁的发现。我国学者从实践中总结了宝贵经验,归纳上升到理论(1)生物同型基取代说,(2)活性成分相结合,(3)受体假说,(4)药物潜伏化,(5)中草药有效化学成分配位化学学说,并获得一些成果。总之,从以上多种途径拓展了由中草药有效成分创新的广阔领域,成功率高。它是当今摆脱我国西药研究以仿制为主的被动局面的出路所在。此外,有关近代生物转化和生物合成理论和技术,也应认真汲取,以开阔新药研制思路[6]。
2. 进行新药的二次开发
对过去研究方面得出的一些不太成熟的成果进行系统的学习和总结,选择有潜力的苗头进行二次开发。从分离出混合组分作为药物的可以进一步把各个单体分开,分别检验其疗效,然后或者单用,或者用化学单体组方。如抗感染的双黄连和抗风湿性关节炎的白芍总甙[1]。又如最近报道的常用中药黄芪通过系统成分分析,从黄芪总皂甙分离出21种成分,其中黄芪皂甙Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ治疗心力衰竭有效,以黄芪皂甙Ⅳ疗效最佳,可能成为新型的非洋地黄类强心药物。又据最近信息,美、韩从高丽参发现一种全新成分人参甙Rf,可能作为新型非成瘾性高效止痛剂[6]。
3. 从古方、验方研究开发中药新药
古方、验方通常是千百年来临床经验总结,许多方剂疗效确切,这是我国的优势,是新药研究的前提。从临床、药理证明青黛是治疗慢性粒细胞白血病"当归芦荟丸"的有效单味药,从中分得有效成分靛玉红,再经结构改造合成了"异靛甲",其疗效更高,毒性更小。陈竺教授等对民间用于治疗淋巴结核、皮肤癌等有效的验方(含砒霜、轻粉、蟾酥)逐一筛选,从复方到单味中药砒霜,又到化学纯三氧化二砷,终于研制成功"以毒攻毒"的"癌灵一号"注射液,创造了白血病临床治疗的"人间奇迹"。
4. 加强中药有效部位研究,提高中药新药研制水平
中药有效部位研究,可为相关学科的融合渗透提供新的增长点和新领域,创造有中国特色的新医药学。
中医临床用药的主要形式是中药复方,它是中医理法方药的具体运用,体现了中医治疗重视扶正祛邪,标本兼治等整体观、系统论和辨证施治的法则,是多系统、多靶点和多层次发挥全方位药效作用的治疗方法,所有这些都非单一成分所能概括达到的。根据中医理论和临床经验,开发中药复方的有效部位能较好地显示这种优势和特色[4]。
乔延江等从化学的角度对有效中药复方研究进行了全面的探讨[7]。因为复方药效不仅与药效物质或药效物质群有关,而且与辅助成分也有关。因此,越来越多的人开始进行所谓的多模式、多指标控制体系的研究工作。化学模式识别被认为是较理想的方法之一,用化学计量学的方法关联化学数据阵与药效数据阵,确定可用于复方质量控制的模式,并对未知样本进行识别。直接试验方法应用于中药复方全方筛选、优化研究取得了可喜的结果;直接试验 设计运用蒙托卡洛方法,在规定的实验域内随机模拟取点,结合药效实验,经分析、整和、比较、评价等操作,最终确定"最优"复方。确定复方有效部位,探讨有效部位的主次(即有效部位的君、臣、佐、使),建立复方量效关系,对有效部位中主要药效物质基础或者主要药效物质群的研究是中药复方化学研究的重点,也是探明中药复方配伍规律、药效作用机制的基础。只有这样才能不断推出组方合理、工艺先进、高效安全、体现中医药特色的中药新药,推动中药走向世界。
5. 将生物技术应用于中药新药的研究
应用生物技术特别是基因工程,对于开发新药有重要的指导意义。中药化学成分代谢关键酶的基因调控、发酵培养条件的调控,可以大大增加有效成分的含量,在研制开发中药新药的过程中,对活性成分的分离纯化,构效关系的研究,定向诱导有效活性成分的生成,新剂型、新工艺的研制等都可应用生物技术[8]。
6. 测试分析方法的现代化是提高中药新药研制水平的保证
长期以来检测中药及其制剂是以TLC、HPLC等为主,这些手段所提供的参数,如Rf值、tR值等都不是绝对的,而是仪器设备依存的;作为标准参数,尚存在一定困难。从分析仪器发展的趋势来看,联用技术将会逐渐替代独立的分离和分析仪器。气质联用(GC/MC)或气相色谱?傅里叶变换红外光谱联用(GC/FTIR)或气相色谱?傅里叶变换红外光谱?质谱联用(GC/FTIR/MS)用于中药挥发性样品分析。电喷雾(ESI)或离子喷雾技术以及近期发展起来的大气压离子化技术能够把极性强、不挥发和热不稳定的化学成分的离子从溶液中蒸发出来,进行质谱分析,从指纹鉴定的角度来看它是远较色谱优越,如质荷比,是一个物理参数,不会受仪器和实验条件不同变化,容易建立标准谱图库;质谱仪提供的分子量是指示成分化学属性的重要参数;对于一些非极性成分可以应用大气压化学电离(APCI)。除上述优点外,还提供液相色谱?质谱(LC/MS)以及液相色谱?质谱?质谱(LC/MS/MS)联用等技术,亦可与新兴的分离技术如毛细管电泳(CE)相结合,使成分分离的能力大大提高;CE/MS和CE/MS/MS是研究中药复杂体系,尤其是复方的有力工具。此外超临界色谱(SFC)和高速逆流色谱(HSCCC)在中药分析中颇为有用。
上述的高新科技仪器无疑会在中药研究和质量析方面产生突破性的冲击,这些高效率和高信息量的分析方法将不可避免地成为质量分析方法的主流[9]。
7. 制剂工艺现代新技术新方法的应用
如微波萃取、超临界萃取、液滴逆流萃取、超声波萃取等和分离技术中的层离技术、大孔吸附技术、凝胶分子筛选技术、模分离技术、超速离心技术等,以及干燥技术的喷雾干燥、冷冻干燥等。此外,尚有新辅料、固体分散技术和β?环糊精包合等技术的应用[4,10]。
8. 其它
重视中药新药新释药系统(drug delivery system,DDS)的研究和海洋药物[6]及中药非处方药的研究开发。
开发恶性肿瘤,艾滋病,心脑血管疾病,肝病,感染性疾病,风湿及类风湿病,老年性常见病如前列腺肥大、骨质疏松、更年期综合症、糖尿病、老年性痴呆等,抗衰老及调节机体免疫功能的补益类等具有高效、低毒、速效、长效的中药新药,将有很好的前景[11]。
三、结语
总之,中药新药的研究开发必须坚持以中医药理论和经验为基础,采用现代科学技术的方法,开展中西医药学相结合的研究方向,多学科的渗透与协作,推行国际规范,走真正创新之路,中药新药在21世纪必将创造辉煌!
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以2015年7月22日印发《关于开展药物临床试验数据自查核查工作的公告》为标志，国家食品药品监督管理总局（以下简称“食药监总局”）以“最严谨的标准、最严格的监管、最严厉的处罚、最严肃的问责”为要求，展开药品临床数据自查核查行动。被业内称为中国医药史上，监管部门对药物研发过程中临床试验数据问题的“最严核查令”。
截至2016年10月30日，食药监总局核查中心共组织检查员681人次，组成81个检查组，对分布在319家药企的148个新药注册申请品种进行了核查。
“风暴”过后的景象可以用惨烈来形容。截至2016年6月底，企业经自查主动申请撤回了1193个新药，占应自查总数的83%；2016年10月，食药监总局药品审评中心共承办新的药品注册申请中，已受理的有209个，创全年最低水平，而上一年同期数量则为548个，且这一数字还是当年的最低峰。因为监管部门大幅收紧的药物临床试验质量审查标准，大陆药企如今已经不再像从前一样，随意提交新药注册申请，而是开始变得谨慎、小心。
物临床试验，是药物研发链条上最重要的环节之一，指药企研发一款新药后，将药品送到医院，在人体（病人或健康志愿者）上进行的药物系统性研究。通过药物临床试验，药企能够了解新药对人体的疗效和毒副作用几何等情况。也就是说，一种药物，究竟有没有疗效、安全不安全，主要靠临床试验数据来衡量。
然而在过去很长一段时间内，因为行业发展不规范、监管能力跟不上等原因，临床数据造假或不规范现象像“潜规则”一样，在中国相关行业内大量存在，且一直未有得到社会足够的关注。
虽然此次突然对药物临床试验严格审查，让内地制药界出现了阶段性的“退潮”。但是仍需看到，药物临床试验造假是一个有着“悠久历史”的问题，其中牵涉多方利益，并非一两次核查能够改变。
正如“罗生门”一样，每一方都有委屈和不满、都希望将责任推到其他机构的身上。在这种背景下，单独依靠提高监管标准与力度，毕其功于一役，大幅提高大陆临床试验质量，进而希望提高国产药质量，效果尚待观察。
撤了83% ：撤回保平安
“崩盘”、“不安”……一年多来，医药行业的朋友圈里流传着许多带有这些字眼的文章，文章都指向一件事――大量药企把自己的新药注册申请撤回了。而这都源于食药监总局开展的药物临床试验数据自查核查工作。
变化始于一年半之前。2015年7月22日，食药监总局《关于开展药物临床试验数据自查核查工作的公告（2015年第117号）》（以下简称“第117号公告”）。该公告指出，所有已申报并在总局待审的药品注册申请人，须对已申报生产或进口的待审药品注册申请药物临床试验情况开展自查，确保临床试验数据真实、可靠，相关证据保存完整。申请人自查发现临床试验数据存在不真实、不完整等问题的，可以在2015年8月25日前向国家食品药品监督管理总局提出撤回注册申请。
对于自查出来的问题，食药监总局对申请人采取了“恩威并施”的策略。
“恩”的做法是，在食药监总局组织核查前，药品注册申请人自查发现药物临床试验数据存在真实性问题的，应主动撤回注册申请，总局只公布其名单，不追究其责任。
“威”则体现在，食药监总局宣布，将组织专家对申请人的自查材料等进行数据分析并视情况开展飞行检查，也就是“突然袭击”式的检查。
检查中被发现临床试验数据弄虚作假的，临床试验数据不完整不真实的，不仅意味着该药品种注册或不予通过，还要“追究申请人、临床试验机构、合同研究组织的责任，并向社会公开申请人、临床试验机构、合同研究组织及其法定代表人和相关责任人员。”
根据食药监总局公开的信息，当时自查核查工作涉及1622个待审药品注册申请，其中新药948个、仿制药503个、进口药171个。
这只是一个开始。此后的一年多时间里，食药监总局又接连《食品药品监管总局关于进一步加强药物临床试验数据自查核查的通知》、《关于药物临床试验自查情况的公告》、《关于药物临床试验数据自查核查注册申请情况的公告（2016年第171号）》等文件，督促自查核查工作的持续进行。
上述一系列的自查核查公告，并没有立刻令众多药企掀起“撤回风潮”。业内人士告诉《凤凰周刊》记者，许多药企对于撤还是不撤曾犹豫了很久。对于申报药企来说，如果选择撤回，意味着前期投入全部“打水漂”。按照食药监总局在2015年12月的《食品药品监管总局关于进一步加强药物临床试验数据自查核查的通知》规定，“对主动撤回的注册申请，申请人可按新的要求重新组织开展临床试验”，如果药企不想放弃注册，就要重新组织临床试验。
业内估计，目前内地一个新药生产批件的价格（即当前国内新药研发成果交易的基准价格）可能已经上涨到超过5亿，而相应的临床批件则不低于4000万至5000万。此外，国家正在提高注册成本和要求，再申报的难度无疑要比之前大大增加。以华海药业为例，在食药监总局2015年11月26日的公告中，其撤回数量居首，多达8个，撤回、不批准率高达90.48%。华海药业在公告中透露，上述8个药品已累计投入的研发费用约3800万元（含部分品种的欧美注册研发费用）。
撤回显然会给药企带来不小损失，但是若等到检查人员在现场核查时发现数据存在问题时，尤其是弄虚作假，不但药品再也无法注册，相关责任人也可能会面临牢狱之灾。
这并非危言耸听，食药监总局也适时了造假的后果。2015年12月7日，总局披露了常州制药厂有限公司申报的阿司匹林缓释片、苏州中化药品工业有限公司申报的瑞巴派特分散片、西安恩慈制药有限公司申报的头孢地尼干混悬剂等14家企业十余个药品的造假情况，并表示“明确注册申请人、药物临床试验机构和合同研究组织的相关人员的责任，涉及医疗机构的相关责任人由卫生计生部门处理，涉嫌犯罪的移交公安机关”。
另外，截至2016年9月底，食药监总局共核查117个注册申请，对其中存在真实性问题的30个作出了不予批准的决定，约占应自查核查品种的2%；对涉嫌数据造假的27个品种11个临床试验机构和合同研究组织（CRO）予以立案调查。
在这样的背景下，大部分药企最终做出了“撤回”决定。一位医药界人士告诉《凤凰周刊》记者：“先撤回吧，虽然自己也不确定有没有问题，但还是撤回保险一些。”
于是，一股“退潮”般的景象展现在世人面前。在符合公告要求的上市和进口注册申请的1622个新药品种中，除去免临床试验的193个申请，共计1429个需要进行自查的品种。截止到2016年6月底，主动撤回数量达1193个，占比83%。
未撤回的仍有25%查出了问题
对于上述景象，有媒体以《八成新药临床数据涉假》为题进行了报道。对此，食药监总局于2015年10月专门发文反驳。一位药化注册司负责人表示，不能简单地把企业主动撤回归结为数据造假。实际上，企业自查主动撤回有多种原因，有的是不符合临床试验质量管理规范，影响试验结果科学性和准确性；有的是数据不完整，不可溯源，不足以证明申报药品的安全有效；也有的数据不真实，不排除有故意造假行为。
该表态说明，食药监总局认为临床试验的问题应该分为两类：一类属于不真实，一类属于“不规范”。按照食药监总局副局长吴浈2015年7月接受媒体采访时的表述：要严格区分数据“不真实”和“不规范、不完整”两类性质不同的问题。数据不真实问题，只要属于主观故意的，必须严肃查处。
由中国药学会主办的全国一级学术刊物《中国临床药理学杂志》2013年进行的一项调查显示，在临床试验的各个环节中，有47.80%的临床试验机构在试验实施过程中违规，更有高达85.70%的机构在试验记录环节存在问题。
此外，从官方口径来看，“不规范与造假”问题也多次被提及。2001年，食药监总局药品认证管理中心检查处处长曹彩在接受媒体采访时承认：“大部分的新药临床研究仍处于不规范状态，在这方面，中药新药的临床试验问题尤为突出。”
2004年，该局安全监管司药品研究监督处一位处长曾透露，在他们以往的监督检查中发现，临床试验存在较多不规范操作和违规问题。
十年后，2015年7月27日，吴浈在部署临床数据自查工作的电视电话会议上仍然表示：“目前药物临床试验中问题比较严重，不规范、不完整问题非常普遍。”
2016年初，食药监总局在给各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局下发的一则通知中指出：“近期，总局针对部分试验项目多、收费低的药物临床试验机构的数据进行现场核查，发现大部分试验项目存在数据不真实、不完整、不规范问题。”
此次核查的最新数据也表明，国内药品的临床数据真实性问题堪忧。截至 2016年9月底，食药监总局共核查117个注册申请。在这些注册申请中，发现存在真实性问题的有30个，占比25%以上。而且，这些数据得来的时间，是在大量企业主动撤回注册申请以后，继续坚持的注册申请本应在临床数据上更为扎实，也就是说，存在作假问题的比例应该比实际情况降低了。
面对追责：利益链条上的推诿与博弈
对这场“史上最严”的数据核查，业内各方普遍给予肯定。石药集团中央药物研究院副院长杨汉煜此前在接受媒体采访时表示，加强药物临床试验数据自查核查等政策，对净化市场环境、促进医药行业创新发展起到了十分重要的作用，“以前很多企业粗制滥造的药品也往上报，根本没有时间静下心好好做创新”。
中国科学院院士、上海市科协主席陈凯先在2015年12月举行的一次会议上表示，在这样的历史背景下，加强药品数据核查十分必要。北京大学药学院药事管理与临床药学系主任史录文则认为，药企撤回注册申请，说明其申报的药品本身就有问题。“如果企业有信心，就应当按照国家的要求和流程做，这样才能保证药品安全有效。”不能用药企的经济损失和公众的健康相比，也不能因此质疑政策的合理性。
不过，大面积撤回、不批准以及被迫终止，给利益相关方不可避免地带来损失：药企面临研发费用打水漂；合同研究组织不仅浪费了很多人力物力，还要承担费用损失，以及继续选择临床机构时的责任和压力。在这种形势下，所有利益相关方，与监管部门一起，彼此推诿、角力，甚至相互指责，在造假行为被曝光后，面对申请撤回所产生的经济损失，以及可能的刑事责任究竟应该由谁来承担，形成了一个“罗生门”。
目前，大陆新药研发链条上涉及的机构主要有五部分：药品生产厂家（又称申办者）、食药监总局、经食药监总局认证的药物临床试验机构（简称GCP机构）、伦理委员会（简称IRB）以及合同研究组织（简称CRO）。
在药物临床试验中，各方分工流程为：药品生产厂家要想将药品上市，必须到食药监总局申请注册。注册手续中的一项为进行药物临床试验。进行药物临床试验之前，药品生产厂家同样需要到食药监总局申请，经审查批准、签发同意后，才能M行试验。
一旦获批，药品生产厂家会拿着批文，选择适合的GCP机构进行试验，但是试验的方案须获得IRB批准。
此外，临床试验由于从设计、实验操作，到数据统计分析，再到申请批文都是一个专业性极强的过程，催生了一种专业的中介机构――合同研究组织。一些药品生产厂家也可能通过委托合同将整个流程外包给这样的组织，直接等待最终的注册批文。
当问题出现，较为复杂的流程与环环相扣的关系，让每一方都在试图将责任推到其他机构的身上。
作为监管方，食药监总局坚称问题主要出在申办者和药物临床试验机构两者身上。2014年，原食药监总局安全监管司药品研究监督处就曾表示，造成临床试验质量不佳主要是申办者对药物临床试验机构的了解不够、缺乏责任心；临床研究机构相对短缺，法规不完善、法规执行情况不好，监管力度不够。
2015年7月，吴浈在接受媒体采访时表示，临床试验数据不真实、不完整，有着深刻的历史和社会原因。不过，主要问题仍然出在药品注册申请人及其委托的临床试验机构身上。
吴浈称，一些药品注册申请人对临床试验过程不参与、不监督，有的授意或者默许临床试验造假。申请人委托的临床试验机构对试验行为没有履行相应的监督责任，有的甚至成为规避监管、弄虚作假的“教唆者”。
药企委屈多：申报时间太长了
药企方面也有自己的委屈。恒瑞医药董事长孙飘扬在不久前的一次行业会议上“申诉”：监管部门在核查问题上，要界定造假和不规范，更要分清责任，打板子要打对地方，不要都打在申报者身上。恒瑞医药作为国内研发的佼佼者，也是目前撤回数量较多的上市药企之一，其一个投资过亿元的1.1类新药（指未在国内外上市销售的药品）刚刚被撤回。
许多药企认为目前国内新药上市前的审批时间过长。以3.1类新药（指已在国外上市销售但未在国内销售的制剂及其原料药）的审批为例，根据专业医学研究组织丁香园Insight数据库的统计，申报临床的平均审评时间为27个月，申报生产的平均审评时间为34个月，审评过程占据整个新药研发时间的64%。而若开发的是同一款新药，美国FDA进行新药审批的平均时长仅为30个月，占新药研发时间的31%。
在中国和美国，新药均享受20年的专利保护期，当药品审核的过程太长时，药品进入市场后的盈利期就会大受影响。药品研发本就需要巨额投入，所以一些迟迟无法盈利的药企便在其他地方“开源节流”了。
此外，药企还对进行临床试验机构充满抱怨。中国对临床试验机构实行资格认证制度，即只有通过药监部门审批的临床机构（多为三甲医院），才可以参与临床试验。但问题在于，药物临床试验机构数量太少，与每年需要开展临床试验的项目数量严重不匹配，导致临床试验机构不堪重负，影响试验的质量、规范。
据重庆医科大学的论文《我国药物临床试验现状与对策研究》援引的2012年数据，我国拥有近6000家药物研发企业和379家认证的药物临床试验机构。而官方公布的数据显示，在2012年当年经批准开展药物临床研究的项目高达704个。
“特别是一些针对不常见疾病的药物临床试验，药企的选择就只有几家医院，恨不得要跪着求这些医院来做试验”。一位药企前工作人员告诉《凤凰周刊》记者，按照惯例，药企往往会派出监察员（CRA）对临床试验机构进行监督，但因为缺乏第三方的监督与制衡，同时又是主动请求医院接受试验，所以很难对医院的不合规行为进行监督。
医院喊冤：临床试验数据真实性难控
负责临床试验的医院，也常常抱怨自己的难处。中国医生临床任务过于繁重，再加上临床试验对于医生的待遇和职位晋升没有促进作用，所以医生并不愿意花费过多的精力管理临床试验，一般由下属医生或研究生完成，进而导致临床试验质量不可控。
比如，有医生没有及时记录数据，等试验结束后两年核查时，凭回忆填补表格。而这种没有基于原始数据的无意识行为，会造成恶劣的后果，直接影响数据真实性。一位某三甲医院的医生向《凤凰周刊》记者透露，很多医生不愿接新药临床试验的工作，因为有的药企给的报酬较少，而一旦后期使用出现问题，药监局又可能让医生和医院承担较大的责任。
此外，对于参加临床试验的病人，医生也非常难以控制。卓永清是中国外商投资企业协会药品研制与开发行业委员会（RDPAC） 执行总裁，曾经参加过多例药品临床试验。他告诉《凤凰周刊》记者，在一些地方的医院，有的病人没有参加医保，为了报销额度，会冒用亲戚朋友的身份看病。由此导致的问题是，医生根本无法掌握前来看病的患者的真实情况，进而影响临床试验的质量。
作为连接医院和药企的中介机构――合同研究组织（CRO），则成为众矢之的。由于这些机构的主要工作是帮药企完成临床试验以及繁杂的申报手续，并以此赚取服务费，因此，很多药企和临床试验机构都认为，为了更快更多地获取利益，CRO是药品临床试验造假的主谋。
CRO参差不齐的服务水平，会造成“劣币驱逐良币”的市场隐患。目前，国内CRO行业缺乏准入门槛，相关规定只要求“依照合同提供技术服务的能力”并且是“正规的法人组织”就可以，导致CRO企业数量多、规模小，恶性竞争严重。
据制药行业专业媒体《E药经理人》报道，在2016年春节后的某交流会中，食药监总局某官员直接放话：凡临床试验的合同金额低于10万元肯定造假。很多行业人士认为，这种说法在某种程度上是合理的，“几万块钱，连试验要用到的试剂都买不起，唯有系统地编造数据才能完成任务。”
但CRO机构同样认为自己很冤枉。多位曾经就职于这类机构的人士告诉《凤凰周刊》，CRO经常处在一个非常尴尬的地位：有药企认为自己已经购买了服务，所以要求CRO无论采取何种手段，必须保证临床试验结果符合标准；与此同时，一些临床试验机构又非常抢手，CRO经常需要放低身段来请求医院接受临床试验，所以对于医院的一些不合规行为，CRO也只能默许。
“严进宽出”的监管模式亟待改善
2009年，食药监总局南方经济研究所、《中国处方药》和中国外商投资协会药品研制与开发行业协会（RDPAC）联合的《中国药物临床试验现状和发展》调研报告明确指出，中国药物临床试验发展的最大障碍是“严进宽出”政策，即药物临床试验审批期过长、流程繁琐，但对临床试验实施和上市后药物监管不足。
虽然2015年7月22日之后，食药监总局对存在真实性问题的30个品种作出了不予批准的决定，对涉嫌数据造假的27个品种11个临床试验机构和合同研究组织（CRO）予以立案调查，但在此之前，自 2001 年的《中华人民共和国药品管理法》规定，申请药品被“枪毙”、相关机构被处理之后，缀醪椴坏揭蛄俅彩匝榻锥问据造假而被公开处理的药企、医院机构或 CRO 公司名单和信息。
相互指责的“罗生门”说明了中国临床试验问题背后的原因错综复杂，也和药物临床试验现状、企业的利益博弈，以及中国药品研发的整体发展水平密切相关。由此，也让业内人士普遍认为，此次掀起的“核查风暴”，能否形成长期效果有待观察。毕竟，“运动式”的监管难以持续和常态化，若不制度化，不能触及根本的矛盾点，难以扭转现实。
中图分类号：R282.7文献标识码：A
文章编号：1007-2349（2012）11-0015-03
鉴于中药附子传统减毒防腐的胆巴水浸泡漂洗流程工艺导致总生物碱及多种生物活性物质流失（有研究统计流失率高达81.3%）从而降低附子回阳救逆的主要药效之弊端，笔者用泥附子1次洗净常压加热水解进行工艺改革，结果所制生附子颗粒质量稳定，总生物碱含量高于传统工艺所制附片13倍，安全性高于药典要求。药效学试验除保持传统附片的主要药效外，还明显表现部分增效及添效。在此研究基础上，根据中医经典方《伤寒论》四逆汤原方以生附子入药配伍的原则用对比研究方法，将创新工艺所制作的生附子颗粒与传统工艺所制附片入药配伍的2种四逆汤（配伍药物等量，药材产地一致）进行临床实验室药效比较。研究结果反映在以回阳救逆，补命门真火为主要功效的各项相关药效指标显示，生附子入药配伍之四逆汤各项比较指标优于传统附片入药配伍的四逆汤，此研究将为中医临床提供一种回归经典古方原貌的四逆汤新剂型。
1中药附子的传统加工工艺的创新研究
1.1回阳救逆的首选药——附子中药附子记载于《神农本草经》，其云：“附子一名茛。味辛，温，有大毒。治风寒，咳逆，邪气，温中，金疮，破癥坚积聚，血瘕，寒湿痿躄，拘挛膝痛，不能行走。”后世随着临床的使用、研究积累，对附子辛温大热之药性及回阳救逆，补命门火，通行十二经等功效研究表述甚多，至今该药仍为临床学者所关注。然而，由于附子显著的药效与其毒性的并存，若使用把握不当，又常出现乌头碱中毒而危及患者生命，为此后世在附子的减毒加工上注入了不少心血，以求提高该药的安全性。附子使用的安全性问题至今仍影响滞碍着临床的合理使用。
1.2附子传统加工工艺的弊端如前所述，目前对中药附子的减毒防腐加工工艺，古今学者均提出了不同的质疑，指出了该工艺存在的弊端。如《本草正义》载：“惟此物善腐，市肆中皆是盐制之药，而又浸之水中，去净咸味，实则辛温之气味，既一制于盐之咸，复再制于水之浸，久久炮制，真性几乎尽失，故用制附片者，必以干姜、吴萸等相助为理，方有功用，但用钱许，其力甚缓。……附片二钱，尚不如桂枝三，五分之易于桴应，盖真性久已淘汰，所存者寡矣。”冉懋雄氏也指出：“附子在炮制过程中，经过盐水浸泡、煮、漂片（水漂洗）等多个环节之后，其所含之生物碱大量流失……”。“附子在炮制生产过程中，生物碱减少总量达81.30%。”“建议附子在产地不必进行如此繁复的加工，……”[1]。鉴于中药附子传统加工工艺导致附子活性成分的大量流失，该工艺由于存在降低附子药效并导致资源的人为浪费弊端，显然有研究新工艺取而代之之必要。
1.3创新工艺的减毒与增效中药附子“有大毒”（《本经》云），现代研究表明，其毒性成分主要存在于该药中含有双酯生物碱，故国家药典将质量控制标准定格于双酯生物碱——乌头碱的限量要求上，即乌头碱（C34H47NO11）含量不得超过0.15%的安全性标准。然而双酯生物碱是一种不稳定生物碱，在持续加热水解后能分别失去2个酯基而成胺基醇类乌头碱，并基本保持中药附子的传统回阳救逆主要药效，同时确保临床用药安全。根据这一原理，笔者用泥附子1次洗净常压恒温加热水解提取制粒工艺，一改传统胆巴浸泡漂洗流失工艺，并经毒理、药理药效，植化作附子颗粒与传统工艺加工附片作多项试验指标对比，结果毒理试验其双酯生物碱限量指标超过药典要求标准；药理药效学试验颗粒除能保持传统附片主要药效外还出现增效、添效反应；植化分析提示颗粒所含总碱量高于附片13倍，达到了试验预期结果[2]，为临床提供了一种稳定、安全、增效的生附子配方颗粒。
1.4附子颗粒用于临证入药配方的现实意义由于生附子颗粒的减毒增效特征，避免了传统加工工艺大量流失生物活性的弊端，于中医临床辨证治疗阳虚寒证提供了一种有效新剂型，特别是颗粒剂良好的安全性保障，将使温里回阳首选药附子的药效充分展示发挥，惠及广大患者。另也对中药附子资源的充分利用，避免传统加工工艺无端的浪费找到了一种有效解决方法。
2四逆汤不同配伍药效学比较研究
2.1《伤寒论》四逆汤方君药附子入药原貌东汉张仲景所创四逆汤，主治少阴寒化证并以回阳救逆为其功效特长，后世医家将该方奉为阳虚里寒危证救逆的经典方广泛用于中医临床急、危、重证的抢救，且每能取到显著疗效。中医《方剂学》指出：“回阳救逆剂，主治阳气衰微，内外俱寒，证见四肢厥逆，恶寒踡卧，呕吐腹痛，下利清谷，精神萎靡，脉沉细或沉微时，非用大剂温热以回阳救逆不可。……代表方如四逆汤……”[3]。王子楼[4]认为：“四逆者，四肢逆冷，因证以名方也。凡三阴一阳证中，有厥者皆用之。故少阴用以救元海之阳，太阴用以温脏中之寒，厥阴薄厥，阳欲立亡，非此不救。……故以生附子、生干姜彻上彻下，开辟群阴，迎阳归舍，交接十二经。反复以炙甘草监之者，亡阳不致于大汗，则阳未必尽亡，故可缓制留中，而为外召阳气之良法。”
国内温阳派代表人物吴佩衡先生[5]认为：“四逆汤为少阴虚寒证之主要方剂……本方不仅能治太阳以及三阴寒化证，如得其要者，一方可治数百种病，因病加减，其功用更为无穷。”笔者从《吴佩衡医案》中成功的挽救三阴寒化证的案例中完全能感受到上述的临床实证。
那么仲景四逆汤组成的原貌如何呢？其为：炙甘草二两、干姜一两半、附子一枚，生用去片，破八片。
右三味，以水三升，煮取一升二合，去滓，分温再服。强人可大附子一枚干姜三两。
《伤寒论》四逆汤原方为何只用生附子而不用炮附子呢？鉴于中药附子在四逆汤中的重要药效，这一问题就很值得笔者思考。后世普遍共识指出，生附子回阳救逆，取其药力之峻；熟附子温阳补火，取其药力之续。故仲景治少阴寒化证真阳欲脱，生机反掌于顷刻之时，必以生附子组配以救逆，诸如四逆汤、白通汤、通脉四逆汤以及白通、通脉四逆加猪胆汤等救急方。时下国内以生附子组配四逆辈救急方近乎为零，多代之以市售制附片组配四逆汤，这不仅有悖于《伤寒论》经典名方组配原貌，而且降低该方药理药效是不言而喻的。笔者在前期——附子传统加工工艺的创新研究——研究成果的基础之上，决定以创新工艺所制作的生附子颗粒组配之四逆汤与传统市售附片组配的四逆汤在恒定组方药物剂量及药品产地等统一标准下设计“四逆汤不同配伍药效学对比研究”课题，以中医经典名方回归原貌的现代剂型作中药复方新药探索研究，欲为中医临床治疗急、危、重症及疑难杂症提供一种中医特色突出的安全、稳定、质量可控、便捷有效（增效）的以生附子配伍的四逆汤颗粒现代剂型。
2.2实验设计及项目试验结果实验设计内容分别为：生附子组配之四逆汤颗粒的工艺及稳定性实验、颗粒剂的急性毒性试验、药效学对比试验、临床疗效对比观察试验等项内容。
为保证项目的新颖性作了开题、结题查新报告，结题查新检索提示：“在检索范围内，国内未见与本课题相同的研究文献报道。”“国内未见针对生附子进行的四逆汤不同配伍药效学对比研究相关文献报道。”以上检索结果客观显示本项研究的新颖性、先进性及在中医经典方的回归原貌药效学比较研究上处于国内领先地位。
工艺及稳定性实验显示该颗粒剂助悬性、成型性、稳定性均较好，微生物合格且未检出双酯生物碱；毒理试验各项指标与对照组无显著性差异。给药组最大给药量达80g/kg，按体重系数折算，成人（60kg）日用量达4800g，为临床拟定量的160倍，高于临床用药量100倍，该颗粒剂是安全的；药效学对比试验显示，试验组（生附子组配四逆汤组）与对照组（制附片组配四逆汤组）对豚鼠离体心肌缺血的冠脉流量观察差异有非常显著性意义，对小鼠耐寒冷能力、耐缺氧能力差异有显著性意义。说明试验药物较之对照药物改善上述指标有明显优势；临床疗效对比观察显示，临床拟定各项指标分析总结，120例随机分为试验组40例，对照组80例（制附片组配四逆汤观察组40例、常规中医辨证施治组40例），显效率分别为试验组70%，对照组中制附片四逆汤组20%，常规中医辨证施治组32.5%，组间χ2分析P
综上所述，生附子组配之四逆汤实验总结果显示，《伤寒论》四逆汤的原创药物组配方功用药效较之后世以制附片组配之四逆汤有明显优势，回归中医经典名方比较研究项目合乎预期分析研究预测。
3结语
历时两千多年的中医药发展史中，名方、验方可谓汗牛充栋，东汉张仲景《伤寒论》中的方药，被后世历朝中医同仁奉为经典名方，传承使用研究至今仍方兴未艾，其中四逆汤一方可谓伤寒方中皎皎者。为什么？其临床疗效的可重复性是其关键。该方为中医临床回阳救逆首选方，其适宜对急危重症辨属阴寒内盛阳气欲脱，厥逆吐利之险证的救治，且方药抢救成功率为业内公推。
鉴于为提高中医临床疗效，尤其是针对中医药在急危重症抢救之有效介入，不仅便于突出中医特色，同时也是振兴中医药事业的需要。笔者研究设计了保持中医经典方原创性的回归原貌比较学研究项目，从工艺设计到毒理、药理、临床系统研究，实验结果证明实验药物——生附子组配四逆汤颗粒剂——具备安全、可控、稳定、有效、便捷的优点，亦圆满完成了中药新药临床预初试验工作。
通过历代中医临床家治疗研究的成果，《伤寒论》四逆汤不仅应用于阳虚阴盛的急危重症的抢救，而且视临床需要以该方为基础进退出入，随证加减使用于老年病、慢性病、疑难病证属阳虚寒证型的治疗，以及阳虚型亚健康人群的防治均具备可操作性。这从时下中国中医药学会主办的“扶阳论坛”讲习班的应答中可略见一斑，中医扶阳大法目前正引起业内人士的关注，但愿关于中药附子的加工及四逆汤回归原貌研究等研究工作能为中医药学术的发展有所裨益，对中医现代化的探索有所启迪。
参考文献：
[1]冉懋雄.名贵中药材绿色栽培技术半夏·水半夏·附子[M].北京：科学技术出版社，2002.
[2]吴荣祖.药品评价[J].药品评价杂志，2005，2（5）.
[3]许济群.方剂学[M].上海：上海科学技术出版社，1985.
优秀研发技术管理人才匮乏影响国内药品研发的整体水平
影响国内药品研发水平的因素众多，比如政策环境、市场环境、资金投入等等，但就具体研究机构或部门而言，缺乏优秀的药品研发技术管理人才却是导致研发层次低下的直接原因之一。很多的研发人员不能很好地审视和判断项目是否可行，为了按时完成老板的“作业”，常常不求甚解地编写一套又一套申报材料。这样的药品研发自然造就不了高素质的研发管理人才，而高素质研发技术管理人才的匮乏又极大地限制和阻碍了国内药品研发的整体水平。
药品研发技术主管的职责
研发技术总负责人的职责，简单地说就是从技术上管理和把握药品研发的全过程。药品研发是个大的系统工程，作为一个药品研发单位或机构的技术总负责人，不仅应该了解药品研发的相关环节，而且应该能够全过程参与，在参与的过程中制定研发管理流程、不断优化和升级管理流程，并且随时处理和协调研发过程中出现的各种技术问题。
优秀药品研发技术管理人才的素质要求
做为一名优秀的药品研发技术管理人才，必须同时具备较高的技术素质与管理素质。
技术素质方面：能够掌握药品研发的常规技术和关键点，清楚药品研发的各环节间的关联并能很好地把握，深刻领会主要相关行业政策、产业政策特别是药政法规，跟踪药品研发领域的新技术、新产品、新工艺并能够不断思考其在具体研发实践中的应用。能够把握药品市场的最新变化，了解临床用药的规律与特点。
管理素质方面：能够不断提出和确立药品研发的目标，不断判断哪些是药品研发所需的资源（信息、技术、人才、设备等等），能够有效地配置、使用、组织和管理内部及外部研发相关技术资源。研发技术管理人员的管理素质体现在能否制定清晰的研发管理流程、不断升级管理流程上，体现在能否随时处理和协调研发过程中出现的各种技术问题，体现在所管理的技术团队研发效率的高低上。
如何才能成为一名优秀的药品研发技术管理人才
（1）要善于不断扩充自己的专业知识，逐步形成扎实系统的药品研发知识结构
如前所述，药品研发涉及多个专业，许多药品研发技术管理人员由于来自于某个具体专业领域，往往仅熟悉药品研发的个别环节或学科，对其他相关学科或领域则知之甚少，这必然导致技术管理上出现一些盲区，影响对一个项目的系统全面的把握和统筹管理，同时也会让技术人员感到外行管内行。
作为技术管理人员，学习专业知识不是要成为药品研发所有专业的专家，而是要从对技术环节把握和管理的角度来学，要通过不断扩充，逐步形成扎实系统的专业知识结构。随着技术管理层次的提高，诸如药品市场信息、人才信息、国内外研发动态等都应该纳入自己的学习范围。
(2) 要善于在研发实践中不断积累和总结
研发技术管理人员要善于带领技术人员在完成具体研发工作的同时注重技术的积累与沉淀，把研发过程中形成的好的方法、路径、流程总结出来、积累起来，分清哪些是共性的，哪些是个性的，以此指导本单位今后的研发实践，并且在以后不断的实践中进一步积累与总结。
我在做项目负责人时首先带领技术员编写适合本单位使用的标准试验操作规程（即SOP），这个SOP是在吸收和消化了诸如药典、SFDA有关技术指导原则、药品评审会上专家的意见等反复修订而成，实用性和规范性都很强，不仅极大地提高了试验层面的工作效率与质量，而且大大规范了技术员的试验操作和试验记录的书写，避免了同一个试验不同技术人员一个人一个做法的混乱现象，减少了由于技术员流动性较大对研发质量和效率带来的影响。
(3) 善于思考，勇于超越和创新
近年来，国内研发的新药从其本质上说绝大部分仍属于仿制药的范畴，一些技术人员对药品研发的前途感到悲观，对药品研发的过程也因为多是机械性的重复工作而渐失兴趣。其实，即便是仿制开发已有国家标准的药品，也是技术性、专业性、创新性很强的工作。许多品种由于上市时间久远需要提高质量标准，许多品种原料药收率低或制剂稳定性差，还有一些药品在临床使用过程中发现生物利用度较低以及血管刺激性大等安全性问题。药品研发技术管理人员要不断思考新的环境和形势下技术机会何在、技术路径何在、研发的瓶颈何在，通过团队的超越探索建立新的研发模式、找到新的品种选项思路、形成更有效的组织模式。
(4) 善于沟通、交流与合作
技术管理工作处在技术和管理的连接处。在行政主管面前，技术主管是技术人员，在技术人员面前又是管理人员。因此对于高级研发技术管理人员，具备一定的沟通能力是十分重要的，要舍得花时间沟通，要不断琢磨沟通的艺术和方法。与主管领导或是“老板”的沟通可以很好地领会领导的意图，同时帮助其科学地决策和管理；与技术人员沟通得好则不仅能够使项目计划很好地贯彻，而且也能充分调动技术人员的积极性、创造性，同时有利于把握研发质量，有利于从研发实际中总结宝贵经验。
除了重视内部的纵向沟通，也要加强与国内外其它研发同行间的交流与合作。闭门造车只能导致封闭与落后，在相互交流与合作中修正自己、提高自己、丰富和发展自己。为此，我积极参加药品研发方面的一些论坛、会议，并且于2004年10月发起成立了“同写意药品研发沙龙”，目的就是为了与更多的研发人员交流心得体会，利用这个交流平台汇集药品研发的实用路径，系统总结国内药品研发的技术与管理经验，形成真正实用的药品研发体系，使药品研发人员特别是技术管理人员在相互交流中共同提高与发展。
(5) 热爱药品研发工作，把药品研发当作自己神圣的事业来做
关键词 大孔树脂 中药 分离 纯化
中图分类号：R284.2； TQ460.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2013）19-0046-04
大孔树脂又称全多孔树脂、聚合物吸附剂，它是一类以吸附为特点，对有机物具有浓缩、分离作用的高分子聚合物，是吸附性和筛选性相结合的多孔性高分子材料。通过物理吸附从溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离纯化的目的。其理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类及强离子、低分子化合物存在的影响，在水和有机溶剂中可吸附溶剂而膨胀。比其它天然吸附剂（或凝胶型树脂）具有较大的吸附能力、洗脱容易、机械强度高和抗污染能力强等优点。特别是其孔径和孔度大小、比表面积、极性等性能都可以人为控制调节，供任意选择，近几年来，由于大孔吸附树脂新技术的引进，使中药有效单体成分或复方中某一单体成分的指标得到提高。它具有快速、高效、方便、灵敏、选择性好等优点，因而发展速度很快，应用面很广。本文对其在中药提取纯化中的应用做一综述。
1 中药或天然药物中有效单体成分的分离纯化
1.1 黄酮类
黄酮的分离、精制纯化常用此技术。魏涵等[1]利用大孔树脂HPD100、 HPD400、 HPD450、 HPD500、 HPD600、 HPD722 和HPD101富集纯化披针新月蕨中的黄酮类成分，结果发现HPD500对其有效成分吸附效果最好。朱会霞等[2]采用大孔树脂对山茱萸黄酮进行分离纯化，确定其分离纯化条件，树脂的筛选实验结果和静态吸附动态学研究表明，所选的4种大孔树脂，AB-8树脂属于快速吸附树脂，吸附率和解吸率都很高，是用于山茱萸黄酮分离纯化的理想树脂。柯小温等[3]用HPD600型号大孔树脂与ZTC天然澄清剂联用优化纯化条件后，总黄酮含量提升近10倍，既可提高产品内在质量，又能缩短生产周期、减少有机溶剂的使用、降低成本，值得推广。
对于异黄酮类有效成分大多用HPD101型树脂纯化分离。方建等[4]先用聚醚砜有机膜对豆粕乙醇提取液进行超滤，然后用HPD101大孔树脂纯化，研究大豆异黄酮的精制工艺。结果表明，用孔径5 000 D的有机膜超滤处理豆粕乙醇提取液，能够去除其中56.1%的杂质，再用HPD101大孔树脂纯化，能得到纯度为41.2%的大豆异黄酮产品，大豆异黄酮的总收率为65.7%。综上所述，大孔吸附树脂对黄酮类成分进行分离、精制纯化等工艺研究都取得了较好的效果。
1.2 生物碱类
大孔吸附树脂在生物碱吸附方面的研究多以生物碱的吸附量和洗脱率为考察指标，对国内常见大孔吸附树脂型号进行筛选。秦学功等[5]以苦参总碱吸附量和解吸率为指标， X-5型非极性大孔树脂能直接从苦参渗漉液中快速吸附分离生物碱，吸附量大、解吸容易，并对环境、产品无污染，极具开发成绿色工艺的潜力。周洪雷等[6]比较HPD101、AB-8（安徽）、DM301、HPD100、AB-8（河北）等5种大孔树脂对钩藤总生物碱的动态吸附率和动态解析率，以钩藤总生物碱含量为指标筛选大孔吸附树脂上样条件和洗脱条件，结果AB-8大孔树脂对钩藤中总生物碱有最好的吸附分离性能。董洁等[7]通过静态、动态吸附和解吸动力学试验，筛选最佳大孔树脂，结果HPD100对浙贝母总生物碱的富集综合性能较好，并优选其纯化工艺，可使浙贝母总生物碱含量>65%。其他生物碱方面的研究还涉及黄连、黄柏、平贝母中总生物碱，石蒜中的石蒜碱以及乌头碱等。
1.3 皂苷类
大孔吸附树脂技术在皂苷类化学成分分离纯化方面的应用比较成熟，常用于皂苷的型号主要是HPD101。此外，应用的型号还有S-8，HPD100，DM130，ADS-7等。卢凤来等[8]研究HPD101大孔树脂分离纯化番茄总苷的工艺条件及技术参数，采用高效液相色谱法测定番茄皂苷A的含量，考察HPD101大孔树脂对番茄总苷的吸附及解吸性能。结果表明，HPD101大孔树脂对番茄总苷的纯化方法可行，具有较好的应用前景。Wu等[9]先从10种大孔树脂中初步筛选后用HPD722型树脂分离纯化，川续断皂苷Ⅵ的产量提高了近10倍，从6.27%提高到59.41%，为得到更高产率，又从另5种大孔树脂筛选出ADS-7型进一步纯化提取，使其产量可以从59.41%提高到95.05%。
1.4 多糖类
大孔吸附树脂对多糖类的纯化研究日趋受到重视，影响吸附洗脱效果的主要因素为pH、上样量、上样液浓度、流速和洗脱剂。任海伟等[10]为提高薏苡多糖纯度，以吸附量（率）与解吸率为评价指标，从6种大孔吸附树脂中筛选适宜的树脂，并采用静动态吸附-解吸方法优化工艺，结果表明，AB-8树脂纯化薏苡多糖效果更佳。李元元等[11]以吸附率和解吸率为评价指标，选定DM-2型大孔树脂分离、纯化沙枣多糖的最佳工艺条件，通过动态试验研究各因素对分离、纯化效果的影响，确定在实验设定条件下，DM-2型大孔树脂分离、纯化沙枣多糖的效率较高。
1.5 萜类
大孔吸附树脂对环烯醚萜类化合物的吸附是近年来比较新的研究方向，尤其是对环烯醚萜类和总三萜类成分的研究。余晓晖等[12]采用不同型号的大孔吸附树脂对黄管秦艽中裂环烯醚萜类化合物进行吸附和解吸实验，并研究其工艺条件和参数，同时采用紫外分光光度仪分析检测，结果筛选出效果较好的HPD100大孔吸附树酯，确定了最佳工艺条。宋歌等[13]采用高效液相色谱法测定蜘蛛香中环烯醚萜类成分11-ethoxyviburtinal的含量，并以此为指标，采用单因素考察、正交试验设计法对上样溶液浓度、洗脱溶剂、洗脱流速等进行考察及优化。结果表明，AB-8大孔吸附树脂具有良好的吸附分离性能。孟宪军等[14]对5种商品化大孔树脂吸附纯化北五味子藤茎中总三萜的性能进行对比筛选，发现AB-8树脂对北五味子藤茎总三萜具有最大的吸附量。经过AB-8树脂纯化，产品的洗脱率达90.52%，纯度达34.26%。
1.6 有机酸和酚类
有机酸或酚酸类的抗菌、利胆、升白等作用也越来越受到关注。熊伟等[15]通过静、动态吸附和洗脱实验，筛选出306型大孔树脂为绿原酸的吸附树脂，洗脱液经浓缩干燥后得绿原酸粗品，纯度达40%以上。李佳彦等[16]研究应用大孔树脂富集泽兰中酚酸类成分，富集原儿茶醛和咖啡酸的最佳树脂型号为HPD600，而富集迷迭香酸的最佳树脂型号为AB-8。陈伟等[17]筛选出对升麻中总酚酸吸附效果最佳的HPD600大孔树脂，设置系列的正交实验优选最佳制备工艺，将药材提取液进行2次吸附洗脱，精制升麻总酚酸，结果升麻总酚酸含量达到50%以上。魏冬青等[18]以丹参总酚酸的含量和转移率为指标，采用HPD100型大孔吸附树脂纯化丹参酚酸的最佳工艺条件，丹参总酚酸纯度可达60%以上，转移率约45%。
1.7 色素
大孔吸附树脂在色素分离方面有其不可替代的优势，该技术具有对色素吸附量大，易解吸，目标成分损失少，富集得到的色素纯度高等特点。主要涉及的色素有原花青素、番茄红素、原花色素、红花黄色素。李干禄等[19]为利用大孔吸附树脂分离纯化三孢布拉霉菌发酵液番茄红素，考察了4种大孔树脂（HP20、 HP2MG、SP825、SP207）对番茄红素的吸附-解吸特性，筛选出最佳树脂。结果表明，HP20大孔树脂对番茄红素具有较好的吸附-解吸性能，且吸附迅速，回收率可达89.55%，重结晶后纯度达95%以上。武永刚等[20]用水超声法提取菊科植物红花中红花黄色素A，提取液经HP D101大孔吸附树脂色谱柱进行粗分，洗脱物用中压制备色谱进行两次分离纯化，所得产物羟基红花黄色素A纯度为95.97%。
2 中药复方制剂分离纯化
中药复方是中医临床治疗的主要形式，然而中药复方制剂“粗、大、黑”问题严重制约了其发展。由于其成分复杂，必须根据功能主治明确其有效成分的类别和性质，确定大孔吸附树脂的型号和用量，以达到提高有效成分的相对含量的目的。王淑美等[21]利用AB-8型大孔吸附树脂对复方脑脉通颗粒的有效部位进行纯化，以总蒽醌、总皂苷、总生物碱及葛根素的含量为指标，优化了大孔吸附树脂的纯化工艺条件，使有效部位的纯度达到63%。刘若霞等[22]以比色法测定泄浊除痹方中总皂苷含量，采用静态吸附-解析筛选树脂类型，并对影响分离的各种因素进行系统研究，结果经HP D101树脂处理后的泄浊除痹方总皂苷可达80%以上。此外还有应用大孔吸附树脂对中药复方免疫增强剂中多糖的纯化，苏郁滴丸中柴胡郁金提取液的纯化，葛根丹参药对水溶性有效物质的纯化，芍药甘草汤的分离精制等研究报道。
尽管如此，大孔吸附树脂技术应用于中药复方制剂尚存在一些实际问题，如应用于复方中药的等效性、技术评价的科学性等。有专家提出，经过大孔树脂处理后的复方提取物是否能够代表原提取物的“药性”，该如何用确凿的证据证明该过程是去除了无用的成分，保留了有效成分。因此，仅以纯化、减少浸膏为目的而将中药复方用大孔树脂处理的做法，由于缺乏较多的研究基础，很难充分说明采用树脂纯化的必要性及合理性，在评价上的依据也不很充分。研究者应该在充分考虑临床疗效和安全性的基础上研究中药复方提取、纯化工艺路线，如需用大孔树脂处理应充分解决好其基础研究问题，使该方法具有充分的科学性、合理性和可行性。
3 去除有害杂质
有些中药重金属的含量超标，而大孔树脂可用于去除中药水煎液中的铅、镉、铜。梁贺升等[23]经原子吸收光谱法测定，通过D001、D113与D751型大孔吸附树脂处理后都能够显著脱除中药水提取液中的铅、镉、铜的含量，普遍脱除率都在58.9%以上。
药材与饮片不同，用于制药和临床的是饮片，药材是生货原药，是饮片加工的前体。
中药农药残留的问题近年来也成为了新的焦点，大孔吸附树脂技术在这个领域可以发挥重要的作用。魏艳彪等[24]进行了大孔吸附树脂对吡虫啉的吸附性能的研究。吡虫啉作为一种低毒高效的杀虫剂在农业及卫生领域有着广泛的应用。该试验使用了聚甲基丙烯酸甲酯大孔吸附树脂对水中吡虫啉的吸附行为进行研究，为应用大孔吸附树脂处理中药水提液中吡虫啉残留的研究提供了理论依据。
4 多糖脱色与澄清工艺
大孔树脂应用广泛，也可用于制剂澄清和脱色。王佩等[25]对蝉贝口服液澄清工艺澄清度和测定总生物碱含量两项为对比工艺。比较了硅藻土吸附、乙醇沉淀、壳孔吸附树脂吸附5种纯化方法，只有大孔树脂既能保留有效成分又能使溶液澄清，为一种较好的澄清工艺。多糖纯度一般较低，往往含有色素、蛋白质以及一些小分子物质。色素的存在不仅影响多糖的色泽、纯度，而且对多糖的进一步纯化和研究其组成带来一定影响，因此，在多糖分离纯化之前，需进行脱色处理，以方便进一步的研究。川芎多糖、灵芝多糖等应用大孔吸附树脂吸附技术不仅脱色效率高，而且有效成分保留好。
5 结语
目前，大孔吸附树脂技术主要集中应用于黄酮、生物碱和皂苷类等有效化学成分的分离纯化。但是从国家对该技术的关注程度来看，我们有理由相信该技术在中药研究和生产中的应用将会有更广阔的空间。尤其对于近年来出现的用于脱除重金属杂质和农药残留物方面，其既不影响目标成分的含量又不会带入新杂质的特点，是其他方法不可替代的。
随着各项基础和应用研究的不断深入，大孔吸附树脂在分离、纯化中药提取液等方面已日益显示其独特的效果，不仅为中药制剂质量控制和中药现代化研究提供更有效、可靠的纯化富集手段，更重要的是改善了传统中药制剂“粗、大、黑”的外观和服用量过大等缺点，必将有利于中药制剂工艺的改进，并且对中药现代化研究进程有很大的促进作用。
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[关键词] 药物分析；教学改革；经验总结
[中图分类号] R91 [文献标识码] B [文章编号] 1674-4721（2014）02（b）-0126-02
《药物分析》（含中药制剂分析）是我国高校药学相关专业（包括药学、中药学、制药工程、药物制剂专业等）均开设的一门重要专业课程，是本校的广西壮族自治区高校精品课程。《药物分析》课程的任务就是培养学生对不同于一般商品的药品具备强烈的质量控制观念，教会学生运用化学、物理化学或生物化学的方法和技术，研究化学结构已明确的化学合成药物、天然药物、中药、生化药物及其各种制剂的质量控制方法[1-2]，使学生能胜任药品生产、流通和使用过程中的质量控制工作，并能研究、探索和解决药品质量问题的基本规律、基本技能和最佳最新方法。
2011年7月开始，广西教育厅启动了广西高等学校特色专业及课程一体化建设的教学研究项目，本校的制药工程专业和《药物分析》课程有幸被列为资助研究的专业及课程。借这个契机，本校对《药物分析》课程从理论教学、实验教学和考核方法三个方面进行了改革与创新，现将该教学改革的经验总结如下。
1 教学改革之前《药物分析》教学的现状与不足
1.1 重理论轻实验
《药物分析》是一门实践性极强的综合性应用学科，其教学体系主要包括理论和实验教学两部分。但是，以前《药物分析》的理论教学偏重书本知识的讲授，过分强调知识的系统性和学科性，与生产实际结合较少。另外，在最终成绩考核时，《药物分析》课程最终成绩的比例分配是平时成绩（实验成绩）占30%，期末成绩（期末理论考试成绩）占70%，这也使学生偏重对理论知识的掌握，造成实验动手能力不够强的现象。
1.2 理论教学的内容存在滞后性，授课方式也比较呆板
《药物分析》的教科书都是以我国《药典》中的质量标准为基础，系统阐述各类药物的质量控制方法及技术。我国《药典》是每5年更新一版，在新版本的《药典》中，对不少药物的质量标准进行了修改和提升，并引入一些新的药物和新的质量控制方法及项目[3]。但是教科书一般是在新的《药典》出版之后才根据其内容进行修订，待新的《药物分析》教科书修订好并运用到教学当中时，五年一版新《药典》的使用时间已经过半，导致了部分教学内容存在滞后性。另外授课方式以教师讲授为主，课堂气氛比较呆板、沉闷，不利于学生产生积极的学习态度。
1.3 实验教学的内容设置不够合理
实验教学全部为验证性实验，学生做实验就是照着实验讲义按部就班，缺少主动思考问题、提出问题和解决问题的动力和能力。实验能力较差的学生不能完全适应岗位的需求，学生的职业能力滞后于社会的发展，直接影响药学专业人才培养的质量。
2 《药物分析》教学改革的内容与措施
2.1 理论教学改革
①依据新版《药典》对教学内容进行及时更新和调整，使教学内容与新版《药典》内容同步；②鼓励授课教师参加课件比赛，在及时更新授课内容的同时提高课件质量；③改变过去以课堂讲授为主的传统教学方法，代之以灵活多样的适合该门课程特点的各种教学方法，开展启发式、讨论式、提问式教学，甚至让师生互换位置，鼓励学生自制多媒体课件，走上讲台讲解与药物分析相关的某一专题内容，提高课堂中师生的互动效果，改变以往老师台上讲，学生被动听的呆板教学方式，激发学生的学习积极性，有效地培养学生独立思考问题、分析问题和解决问题的能力，锻炼学生的语言组织表达能力，充分发挥学生的潜能，变被动学习为主动学习。
2.2 实验教学改革
根据《药物分析》课程的特点，将实验课分为三个层次：层次Ⅰ为原来“验证性实验”的常规技能训练[4-5]，是在一个设计完整的实验框架下重新验证结果，验证实验结果是否能呈现原理所描述的现象，实验目的是使学生了解这个实验；层次Ⅱ为“设计性实验”训练[6-7]，要求学生通过设计实验掌握某种分析技术的理论基础与运用技能，如在高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）用于药物含量测定的实验中，要求学生对分析方法效能指标进行设计；层次Ⅲ为“综合性实验”训练[8-9]，要求学生能够将所学的书本知识及书本上没有的文献知识，综合运用于实验方案的设计、实验项目的确定以及实验指标的建立等过程，进一步培养学生独立分析问题和解决问题的能力，同时初步培养学生的创新能力[10]，为学生进入毕业专题研究工作奠定必要的基础。
2.3 考核方法改革
为了在考核方法中体现出实验课的重要性，改革《药物分析》课程最终成绩的比例分配：实验课占50%（其中平时实验成绩占30%、期末实验操作考核占20%），期末理论考核占50%。在实验课中增加一个期末实验操作考核，以强调实验动手能力在本门课程学习中的重要性。在《药物分析》开始授课之初，就向学生公开本课程考核的方法，让学生有意识地将理论与实验并重地开展学习，从而改变仅靠期末突击背书通过理论考试就能拿到学分的学风。
2.4 师资力量建设
近几年，《药物分析》教研室通过引进高学历人才和鼓励本教研室原有青年教师攻读博士学位，使本教研室师资的学历水平大幅提高，拥有博士学位的教师人数达到总教师人数的60%以上，为保证《药物分析》的教学质量提供了坚实的师资力量。另外，教研室还鼓励授课教师参加校内外的讲课比赛、课件制作比赛等，为进一步提升教师的授课水平提供了观摩和历练的平台。
3 药物分析教学改革的总结
通过对《药物分析》教学进行系统的改革，对《药物分析》这一区级精品课程进行了建设和提升，使课程内容与时俱进、更具有实用性。同时，既提高了授课教师的授课水平，也培养了学生主动思考问题和解决实际问题的能力，提高了学生的实验动手能力，适应了新形势下社会对药学专业人才的需求。
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【关键词】半边旗黄酮正交实验精制
半边旗PterissemipinnataL.，又名半边蕨、半边莲、单边旗，系凤尾蕨科植物，是一种南方常用草药，始载于《岭南采药录》，称半边旗。该植物有止血、生肌、解毒、消肿之功效，民间用于治疗吐血、外伤出血、发背、疔疮、跌打损伤、目赤肿痛等。现代研究表明，半边旗中含有挥发油、萜类、黄酮、皂苷等多种物质。有关半边旗的药效成分研究主要集中在萜类化合物，半边旗中黄酮类物质的研究报道较少。
黄酮类化合物是中草药中一类重要的药效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等广泛的生物活性，天然黄酮主要以游离的苷元或与糖结合成糖苷的形式存在于植物中。本研究采用正交实验法考察溶剂用量、乙醇浓度、提取次数、提取时间对半边旗总黄酮溶出量的影响，以确定最佳提取条件，并研究了半边旗黄酮的精制方法，为合理开发利用半边旗资源提供依据。
一、器材
岛津LC-10A高效液相色谱仪(LC-10ATVP泵，SCL-10AVP控制器，SPD-10AVP紫外检测器，CTO-10AVP柱温箱)；紫外分光光度计(岛津UV3101PC)；分析天平（Mettler,AE240）；旋转蒸发仪（上海申越科学仪器公司）；四用紫外分析仪（上海顾村科学器材厂）。芹菜素和木犀草素标准品购于天津尖峰植物提取物公司，甲醇为色谱纯（TEDIACompanyInc.USA），提取及精制用乙醇、氯仿、醋酸乙酯均为分析纯（广州大华试剂公司），其他化学试剂均为分析纯。半边旗植物采收于广东湛江郊区，经广东海洋大学杨燕君副教授鉴定为半边旗。
二、方法与结果
2.1半边旗总黄酮的测定
2.1.1标准曲线绘制参照文献，采用紫外分光光度计法并适当调整。精密称定干燥至恒重的芦丁对照品2mg，加适量甲醇溶解，定容到10ml即得对照品储备液。精密吸取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml对照品储备液于50ml容量瓶中，加甲醇至20ml，加入5%亚硝酸钠溶液2ml，摇匀，放置5min，加入10%硝酸铝溶液2ml，摇匀，放置6min，加入新配制的5%氢氧化钠溶液20ml，用甲醇定容至50ml，用分光光度计于500nm处测定吸光度。以浓度(C)与相应的吸光度(A)进行回归分析，得回归方程A=0.1632C+0.0564，r=0.9976。
2.1.2样品总黄酮的测定称取干燥半边旗粗粉10g，加入含溶剂的圆底烧瓶中，按表1的实验设计进行回流提取，过滤，取滤液挥干溶剂，残留物用甲醇溶解，定容到50ml，即得样品溶液，用分光光度计测定500nm处的吸光度值，由标准曲线计算样品总黄酮溶出量。
2.2半边旗总黄酮的提取工艺考察
2.2.1筛选因素水平半边旗总黄酮采用醇提法。经预试验研究，提取过程中可能的影响因素包括溶剂用量（A）、乙醇浓度（B）、提取次数（C）以及提取时间（D）。以半边旗总黄酮溶出量为考核指标，按4因素3水平进行正交实验，因素水平见表1。
2.2.2正交实验设计及结果按L9(43)正交表对半边旗进行提取并测定总黄酮量。结果见表2～3。表2正交实验结果及分析（略）表3最佳工艺验证实验（略）
由表2和表3分析结果可知，在半边旗总黄酮的提取工艺中，各因素对提取效果的影响程度依次为B>C>A>D，且因素B（乙醇浓度）和C（提取次数）的影响具有统计意义，因此应选B2和C2，确定最优水平组合为A3B2C2D3，即溶剂为12倍量的80%乙醇回流提取2次、2h/次。
2.2.3放大的提取工艺验证实验称取3份半边旗干燥粗粉各500g，采用A3B2C2D3最佳工艺条件提取。
2.1.2”方法测定提取液总黄酮含量平均为1.68mg/g生药。提取液减压蒸去溶剂，所得浸膏60℃真空干燥72h，称重得22.9g棕黑色固体，计算得此提取物中总黄酮质量分数为11%。
2.3半边旗黄酮的精制半边旗黄酮的精制采用溶剂抽提法。称取上述粗黄酮适量，按重量比3∶2混入硅藻土，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯进行索氏抽提，分别抽提至无色，取醋酸乙酯溶液，减压蒸干得棕黄色固体即为精制的半边旗黄酮。
2.4半边旗精制黄酮的测定采用峰面积归一化法。以木犀草素和芹菜素混合溶液为对照品，以半边旗精制黄酮为供试品，分别进样高效液相色谱。以供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值确定供试品中的黄酮含量。
色谱条件：色谱柱DiamonsilC18(150mm×4.6mm，5μm)；紫外检测波长283nm；流动相为甲醇-水溶液，按照甲醇含量0～100%梯度洗脱；流速0.2ml/min；柱温为35℃。
对照品溶液的配制：精密称取木犀草素和芹菜素对照品各1mg，置10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，即为对照品溶液。
供试品溶液制备：称取精制的半边旗黄酮约2mg，置10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，即为供试品溶液。
吸取上述溶液5μl，分别进样高效液相色谱。色谱图见图1～2。经峰面积归一化法计算供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值，计算得供试品中已知黄酮含量占84.3%。
三、讨论
以总黄酮溶出量为考核指标，半边旗用乙醇提取有利于黄酮类化合物的溶出，提高溶剂乙醇的浓度，可加快半边旗中总黄酮的溶出速度，从而使溶出量增加。但溶剂乙醇浓度过高时，黄酮物质的溶出量下降，这可能是溶剂乙醇浓度增加，反而使植物细胞脱水、皱缩，不易于溶胀破裂及总黄酮的溶出。
结合正交设计得出优选的最佳因素水平为12倍用量的80%乙醇溶剂回流提取2次，2h/次。正交统计结果表明，提取时间因素的水平对总黄酮含量影响最小，从节能、经济考虑，样品的提取工艺最终采用每次提取1.5h为佳。
采用最佳工艺条件放大提取半边旗，所得提取物中总黄酮溶出量达1.68mg/g生药，总黄酮的质量分数占11%。进一步的研究表明该提取物中还含有脂溶性色素及萜类物质，其质量分数分别占5%和78%。
半边旗黄酮物质主要是木犀草素、芹菜素及其结合的糖苷，精制后的半边旗黄酮成分含量占84.3%，达到新药开发的要求。有关药理及临床实验的结果表明木犀草素在体内具有抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇的作用，芹菜素具有抗炎、降血压、抗动脉硬化和血栓症、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物学活性。因此开展半边旗黄酮的研究，为从该植物中开发新型中药提供了依据，有利于天然植物资源的综合利用。
【参考文献】
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【摘要】
目的优选淫羊藿黄酮类物质的制备工艺。方法设计了6 种提取工艺对粗毛淫羊藿黄酮类物质的制备进行了研究。结果6 种工艺提取物产量顺序为工艺6，1＞ 工艺2＞ 工艺3，4，5。不同工艺提取物总黄酮含量有极显著差异，其高低依次为：工艺3＞工艺1＞工艺2＞工艺4＞工艺5＞工艺6。工艺2，4，6提取物淫羊藿苷含量最高，其次是工艺3，均显著高于其余工艺，而工艺1 提取物的淫羊藿苷含量最低，平均值仅有0.70 %。结论工艺2 和3 较好，其提取物产量、总黄酮含量和淫羊藿苷含量均较高，对相关产业的发展具有一定的参考意义。
【关键词】 粗毛淫羊藿 黄酮 淫羊藿苷 提取工艺
Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of flavonoids from E. acuminatum. MethodsSix extraction technologies were compared by the extracting output and the content of flavonoids and icariin.ResultsThe order of extracting output was Technology-6 and 1 ＞ Technology-2 ＞ Technology -4， 3 and 5. There were significant differences among flavone contents in extracts from six technics， with the order: Technology-3 ＞ Technology-1 ＞ Technology-2 ＞ Technology-4 ＞ Technology-5 and 6. The icariin contents of extracts from technology 2， 4， and 6 were the highest， Technology 3 the second， and they were all significant higher than the others. The icariin content of Technology-1 extract was the lowest， only 0.70%.ConclusionThe better extracting technologies are Technology 2 and 3， which have higher extracting output，flavone and icarii contents from E. acuminatum than others.
Key words：Epimedium acuminatum; Flavoniods; Icariin; Extracting technology
淫羊藿(barrenwort)是我国著名的传统中药，为小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属Epimedium L.多年生草本药用植物，又名仙灵脾、羊合叶等［1］。早在《神农本草经》即记载其“主阴痿绝伤、茎中痛、益气力、强志”。《本草纲目》称其为“坚筋骨，益精气，补腰脾，强心力”。近年来，研究表明淫羊藿的药理主要集中在免疫、生殖系统、核酸代谢、心脑血管系统及抗衰老等方面，同时在抗肿瘤方面的药效研究也取得一定的进展［2］。目前的药理研究认为，该属植物的有效成分是总黄酮，其中核心成分是淫羊藿苷［3］。本属植物大多种类均可药用，以箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿和粗毛淫羊藿使用最多。其中，粗毛淫羊藿由于其具有巨大的野生蕴藏量，以及很高的总黄酮与淫羊藿苷含量，将会成为中药淫羊藿最主流品种之一［4］。
中药提取物是指采用现代科学技术，对传统中药材进行提取加工而得到的具有相对明确药效物质基础以及严格控制标准的中药产品，可作为中药制剂的原料药和食品添加剂［5］。由于中药提取物的标准化相对于原材料标准化要容易得多，所以中药提取物的产业化是推进中药现代化和中药技术创新的重要环节，也是中药进入国际市场最现实的突破口。淫羊藿由于在药用、保健方面具有广泛的应用价值，导致其在提取物市场成为最热门品种之一，国内具有其生产能力的产家就多达数十家。目前淫羊藿提取物的标准是总黄酮与淫羊藿苷两种成分的含量。
到目前为止，淫羊藿提取物产业，已具备了一定的规模，但该提取物的研制、生产、流通等各个环节都缺乏必要的管理规范，使得相关产品众多、规格杂、生产企业多而小、经营渠道杂、经营秩序混乱，致产品质量良莠不齐，这都阻碍了淫羊藿提取物产业化的更进一步发展。本研究设计了6 种提取工艺分别对粗毛淫羊藿进行了提取物的制备，并且对所得提取物的总黄酮与淫羊藿苷含量进行了测定、统计分析比较，来讨论6种提取工艺的优劣，对淫羊藿提取物的制备及其产业的进一步发展提供一定的参考。
1 仪器与试剂
Shimadzu LC-2010A型高效液相色谱仪，YMC Pack-ODS-A 150 mm×4.6mm 型HPLC色谱柱，Shimadzu UV-2450型紫外-可见光谱仪，Sartorius LE225D型电子分析天平，中国药品生物制品检定所的淫羊藿苷标准品（0737-200111），甲醇、乙腈均为色谱纯（默克公司）。
实验材料为粗毛淫羊藿E. acuminatum Franch.，由贵州师范大学植物遗传育种研究所采集队采集于贵州省开阳县，凭证标本（标本号：05060301）存于贵州师范大学植物遗传育种研究所标本室。
2 方法与结果
2.1 6 种提取工艺及其提取物的得率
2.1.1 6 种提取工艺的流程
2.1.2 6种提取工艺的提取物得率及其多重比较每种工艺提取3 次，对所得结果运用生物统计方法中的多重比较［6］来分析这6 种提取工艺的提取物得率高低的次序。结果见表1。表1 6种提取工艺的提取物得率及多重比较（略）
由表1可以看出，6 种工艺的提取物得率具有显著的差异，其中以工艺6 和工艺1 的得率最高，工艺2 次之。工艺3 与工艺4 的提取物得率没有极显著的差异，工艺5 的得率最差。
2.2 6种提取工艺的提取物总黄酮含量测定
2.2.1 对照品溶液制备精密称取干燥至恒重的淫羊藿苷对照品适量，用乙醇溶解，制成1 mg/ml的溶液作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液制备精密称取干燥至恒重的提取物0.1 g，用乙醇溶于100 ml的容量瓶中，超声30 min，放置冷却，定容，作为供试品溶液。
2.2.3 最大吸收波长的测定分别精密称取对照品和供试品溶液1 ml，各置100 ml容量瓶中，按照标准曲线制备项下操作，用紫外分光光度计于220～400 nm波长范围内扫描，得紫外吸收光谱。结果表明，供试品紫外吸收曲线及最大吸收波长270 nm，与淫羊藿苷对照品完全一致，故采用270 nm波长测定供试品的吸收度。
2.2.4 标准曲线的制备分别精密量取对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml置100 ml容量瓶中，置80 ℃水浴中挥尽溶剂，放冷，加硫酸2 ml摇匀，置80 ℃水浴中加热30 min，放冷，置冰浴中加乙醇约80 ml，取出，放置至室温，加乙醇定容至100 ml，摇匀，照分光光度法，以第1 试管为空白，在270 nm波长处测定吸光度。以吸光度（X）对浓度（Y）作标准曲线，得回归方程为：Y ＝18.654 X + 0.587 6。相关系数r＝0.996 1。结果表明，浓度在5～20 μg/ml范围内，与吸收度呈线性关系。
2.2.5 回收率实验取已知含量的样品5 份，精密称取，分别加入一定量的淫羊藿苷对照品，按照标准曲线制备项下操作，结果回收率为101.95 %，RSD为1.46 %（n=5）。
2.2.6 稳定性实验精密称取供试品溶液1 ml，按照标准曲线制备项下操作，依法测定吸收度。间隔1，2，3，4 h再分别测定1次，计算RSD为1.09 %。表明样品在4 h内稳定。
2.2.7 精密度实验精密量取对照品溶液1 ml共5 份，按照标准曲线制备项下操作，分别测定吸收度，结果RSD为1.45%（n=5）。
2.2.8 重现性实验取同一样品5 份，分别按供试品的含量测定项下操作。结果RSD为1.56 %，表明重现性良好。
2.2.9 供试品总黄酮含量测定精密量取供试品溶液1 ml，按照标准曲线制备项下操作，在270 nm波长处测定吸收度，按回归方程计算含量（每种提取物平行测定3 次）。对6 种提取工艺提取物的总黄酮含量进行多重比较分析［6］。结果见表2。表2 6种不同工艺提取物总黄酮含量及多重比较结果（略）
由表2 可以看出，各工艺提取物间的总黄酮含量均有极显著差异。总黄酮的含量的高低依次为：工艺3＞工艺1＞工艺2＞工艺4＞工艺5＞工艺6。
2.3 6种提取工艺的提取物淫羊藿苷含量测定
2.3.1 色谱条件参照《中国药典》的方法［7］，色谱柱为YMC Pack ODS-A 150 mm×4.6 mm；流动相为乙腈-水（25∶75）；流速：1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量：10 μl。
2.3.2 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的淫羊藿标准品，用色谱甲醇配制成0.1 mg/ml，作为对照品溶液。
2.3.3 标准曲线的制备分别吸取淫羊藿对照品溶液2，4，6，8，10 μl上机测定，记录色谱图，以进样量（μl）对峰面积（A）进行线性回归。经计算回归方程为：Y = 2 820 119 X - 49 987.3，相关系数r = 0.995，结果表明淫羊藿苷在0.2～1 μg/ml范围内与HPLC峰面积线性关系良好。
2.3.4 供试品溶液的制备分别精密称取干燥至恒重的6 种提取工艺的提取物，用80 %的乙醇溶于50 ml容量瓶。超声30 min，放置冷却，定容。用0.45 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.3.5 稳定性实验在室温条件下，精密吸取样品溶液在1，2，3，4，12，24 h内进行测定，RSD为1.64%，说明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.6 精密度实验取0.1 mg/ml的淫羊藿苷标准品溶液连续5次进样，峰面积RSD为2.12%。
2.3.7 重现性实验取供试品溶液进行5 次平行试验，淫羊藿苷的含量RSD为1.73%。
2.3.8 加样回收率实验精密称取已知淫羊藿苷含量的样品粉末1.5 g 3份，准确加入淫羊藿苷标准品适量，依法测定，计算回收率。结果平均回收率为99.85%，RSD=1.85%。
2.3.9 供试品淫羊藿苷含量测定运用上述淫羊藿苷含量测定方法对6种提取工艺的提取物淫羊藿苷含量进行测定，对所得结果运用生物统计学中的多重比较进行分析［6］。结果见表3。表3 6 种不同工艺提取物的淫羊藿苷含量及多重比较（略）
由表3可以看出，工艺2，4，6提取物淫羊藿苷含量最高，而且彼此没有差异性，其次是工艺3，它们都显著高于其余工艺。工艺1提取物的淫羊藿苷含量最低，平均值仅有0.70 %。
3 讨论
目前关于不同淫羊藿黄酮提取工艺的比较研究很少。本研究设计了6 种工艺对淫羊藿黄酮提取效果进行了研究。其中，工艺6 提取物产量最高，淫羊藿苷含量也很高，但总黄酮含量太低，暗示有大量其它藿苷类成分丢失，不是一个好的工艺。工艺1 提取物产量和总黄酮含量都很高，但淫羊藿苷含量太低，也不是一个好的工艺。工艺4 和5 提取物产量太低，而且总黄酮和淫羊藿苷含量均偏低，应该不是好的工艺。工艺3 提取物产量中等，但总黄酮的含量最高，淫羊藿苷含量也较高。工艺2 提取物产量中等，总黄酮含量中上水平，淫羊藿苷含量最高。显然，工艺2 和3 应该是较好的可以采纳的工艺。考虑到工艺2 更简单易行、生产成本低，应该是本研究中的最佳工艺。
马维坤等［3］通过正交实验分别对淫羊藿总黄酮的水提工艺及醇提工艺进行了多因素研究，结果显示醇提优于水提，80%的乙醇提取效果最好。刘敏等［2］也认为，乙醇提取率较水提好，溶出杂质少，有利于后续分离，且溶剂可回收，适于工业生产。本研究中，工艺5提取物的总黄酮、淫羊藿苷的含量均较低，暗示水提取的效果明显不如乙醇提取好，与马维坤等［3］和刘敏等［2］的研究结果一致。本研究中最佳淫羊藿提取工艺（工艺2）运用了澄清剂处理，显著地提高了提取物中淫羊藿苷的含量，对改进提取工艺有一定意义。
参考文献
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