1 资料与方法
1.1 一般资料 426例HBV感染者均为本院门诊及住院患者，男334例，女92例，年龄（42.15±11.87）岁，均为汉族，且无亲缘关系。所有病例诊断符合2005年中华医学会肝病与感染病学分会修订的病毒性肝炎诊断标准，同时排除HIV、TP及其他肝炎病毒感染。样本收集均获患者知情同意。按疫病类型将患者分为四组，其中乙肝病毒携带组98例，男62例，女36例；慢性乙型肝炎组116例，男92例，女24例；乙肝硬化组102例，男86例，女16例；乙肝肝癌组110例，男86例，女24例。
1.2 基因组DNA的提取 采用硅胶柱纯化方式，从700 ?L抗凝血液中提取淋巴细胞基因组DNA。UV计测定DNA浓度及纯度，并将样本稀释至10 ng/?L，分装保存。
1.3 PCR-RFLP 从SNPs数据库下载SNP的标准序列，Primer Premier 6.0软件设计引物：上游：5’-3’CCTTTGCCCAGTGTATC，下游：5’-3’TGTATGCCAAGCCATTTG（上海英潍捷基公司合成），内切酶BclI位点T/GATCA（NEB公司提供）。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循环次数35次，72 ℃延迟5 min结束PCR反应。产物37 ℃过夜酶切，65 ℃ 30 min，终止反应。2%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，送上海英潍捷基公司测序验证。
1.4 统计学处理 SPSS 17.0软件进行数据处理，计算等位基因频率和基因型频率，Hardy-Weinberg平衡检验及各组间比较均采用 字2检验，以P>0.01表示符合H-W平衡，以P<0.05表示各组间比较差异有统计学意义，非条件Logistic回归校正年龄及性别等因素，进行关联分析，计算比值比（Odds Ratios， OR）及其95%可信区间（Confidence Intervals， CI）表示相对危险度。
2 结果
2.1 基因型的判定及测序验证 PCR产物及酶切产物见图1～2。
2.2 H-W平衡判定及各基因型、等位基因的频率分布 诊断明确的乙型肝炎患者总计426例，样本经 字2检验，P=0.85，统计学检验符合Hardy-Weinberg平衡，具有代表性，见表1。GG、CC和GC 3种基因型频率及G、C等位基因频率在样本中的分布比较差异无统计学意义（P=0.113，P=0.104）。乙肝肝癌组GG基因型频[dylw.net提供专业写作论文和服务.]率低于乙肝携带组、乙肝肝硬化组、慢性乙型肝炎组，与前两组比较差异无统计学意义（P=0.086，P=0.285），与慢性乙型肝炎组比较差异均有统计学意义（字2=6.152，P=0.046）；GC、CC基因型频率高于其余三组，仅与慢性乙型肝炎组比较差异有统计学意义（P=0.046）。慢性乙型肝炎组G等位基因频率高于乙肝肝癌组，比较差异有统计学意义（字2=5.605，P=0.018）；C等位基因频率低于其余三组，仅与乙肝肝癌组比较差异有统计学意义（P=0.018）。
根据非条件Logistic回归校正年龄、性别混杂因素，以乙肝肝癌组为病例组分别与其他组比较进行分层分析，HMGB1基因位点1176G/C基因多态性在乙肝肝癌组与乙肝携带者组比较差异有统计学意义（OR=0.301，95%CI：0.092-0.989，P=0.048，Recessive model）；乙肝肝癌组与慢性乙型肝炎组（OR=3.792，95%CI：1.206-11.919，P=0.023，Dominant model）比较差异有统计学意义；肝癌组与轻型肝病组（乙肝病毒携带组+慢性乙型肝炎组）（OR=0.227，95%CI：0.061-0.852，P=0.028，Dominant model；OR=0.225，95%CI：0.058-0.866，P=0.03，Codominant model）比较差异有统计学意义，见表2。
3 讨论
原发性肝癌的发生机制复杂，病因尚未确定，目前主要认为与肝炎病毒、致癌物质、饮水污染、寄生虫病等众多环境因素及遗传因素有关。肝癌有明显的家族聚集现象，其本质是因为遗传因素和肝癌之间存在明显的相关性。通过遗传学和表观遗传学改变引起原癌基因活化和抑癌基因灭活是导致肝癌发生的重要生物学过程。我国学者发现人体内存有导致肝癌的易感基因，此举拉开了研究肝癌相关易感基因的帷幕[20]。
HMGB1基因位于13q12染色体上，编码产物HMGB1已被证实参与了HBV感染后肝癌发生的过程，Yan等[12]指出HMGB1通过激活TLR4和RAGE信号通路，促进肝癌的浸润和转移。Jiang等[13]发现HMGB1 mRNA及蛋白在肝癌组织中表达最高，指出HMGB1的过度表达是肝癌发病的一个重要因素。继Kornblit等[14]人首次报道HMGB1基因总共存在6个SNP和4种基因突变后，其基因多态性与SIRS、同种异体T细胞移植免疫反应、产后脓毒症、MODS等多种疾病的相关性已被陆续报道[15-18]。Deng等[19]在研究HMGB1 1176G/C多态性与HBV感染临床表型的关联性分析中指出GG基因型人群对慢性乙型肝炎、肝硬化、急性乙型肝炎的易感性高于CC、GC基因型人群，G等位基因的HBV感染风险明显高于C等位基因，但与HBV感染后肝癌的关联性未予报道。
本研究结果提示，HMGB1 intron4 1176G/C多态性与HBV感染后HCC的发生有关联。携带GG基因型的人群对HB[dylw.net提供专业写作论文和服务.]V感染后HCC的患病风险度增加，该慢性乙型肝炎人群更易发展成乙肝后肝癌，而携带CC基因型的人群感染HBV后发生HCC的风险较低。G等位基因不仅与HBV感染严重肝病密切相关，而且与HBV感染后肝癌的发生相关。HBV感染后HCC的发生，影响因素繁多，遗传背景尤为复杂。在分析其与HMGB1基因多态性的关联性时，种族和地域的差异、样本量不足、来源局限、等位基因连锁不平衡现象、基因突变特征、其他微效基因的相关影响、环境及宿主因素等诸多因素均可干扰 研究结果，要考证其准确性，仍需要多中心、大样本的临床观察及研究。
参考文献
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[关键词] Livin-α基因；多态性；膀胱癌
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（b）-0015-03
膀胱癌是常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，在我国较为多发。目前的研究表明，癌症的发生、发展是一个多因素、多阶段的逐步发展的过程，其中涉及到原癌基因、抑癌基因以及其他生物大分子的激活与失活过程，多个因素的共同作用最终导致癌症的产生[1]。膀胱癌的遗传易感性与人体内多个基因的表达有关，例如：代谢酶基因、DNA修复酶基因等[2]。
Livin是一个人类凋亡抑制蛋白，是一种重要的抗细胞凋亡因子，与肿瘤的发生、发展密切相关。Livin定位于人类20号染色体的q13.3，包含了7个外显子和6个内含子，基因全长为46kb，其mRNA的转录产物有两种，即分别编码298个AA的Livin-α和编码280个AA的Livin-β，其抗细胞凋亡的机制主要是通过抑制caspase蛋白酶途径获得的[3]。研究表明，Livin-α在人类的膀胱癌中具有高表达，而Livin-β则从来没有检出的报道[4]。现有的研究主要涉及Livin基因的表达与膀胱癌之间的联系，几乎没有Livin基因多态性与膀胱癌易感性的关系的报道。为此，本研究对膀胱癌患者的Livin-α基因进行测序和比对分析，以阐明其基因多态性与膀胱癌易感性之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
研究对象为2010年1月～2012年10月内蒙古医科大学附属医院泌尿外科收治的膀胱癌患者80例，其中男46例，女34例，患者平均年龄为（55.4±5.8）岁。所有患者均经组织病理诊断为膀胱癌。80例膀胱癌患者将其作为病例组，其组织病理分级（WHO）为：G1 19例，G2 25例，G3 36例；患者的临床分期（TNM）为：T0～T1为38例，T2～T4为42例。选取同时期于内蒙古医科大学附属医院进行泌尿生殖系统疾病检查的，排除膀胱癌并留取患者血液标本的患者为对照组，共计60例，其中男33例，女性27例，平均年龄为（60.4±3.7）岁。病例组与对照组的性别、年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 DNA样本的提取
病例组和对照组所有对象均抽取静脉血10 mL，经过抗凝处理之后，采用QINGEN（德国）血液和组织DNA提取试剂盒提取所有对象的DNA样本，严格按照试剂盒的操作说明进行操作，并将DNA样本保存于-20℃。
1.3 基因检测
根据文献报道合成引物[5]，序列为：上游5’ -CTGGTCAGAGCCAGTGTTCC-3’，下游引物5’ -TCATAGAAGGAGGCCAGACG-3’，扩增产物片段大小为311 bp。采用Taq Premix预混液（TaKaRa），引物的退火温度为60℃，扩增体系为20 μL，共计35个循环。
扩增阳性的标本将阳性扩增产物送TaKaRa公司进行测序，测序采用双向测定。测序结果用DNAStar软件进行拼接，并用MEGA4软件进行比对分析。
1.4 统计学分析
采用SPSS 16.0对检测结果进行统计学分析，定性变量采用χ2检验，P
2 结果
2.1 病例组与对照组Livin-α基因比较
病例组中经PCR检测有44例患者的Livin-α基因为阳性，其余36例检测为阴性，阳性率为55.0%；对照组中有1例研究对象为阳性，其余59例全部为阴性，阳性率仅为1.5%。经统计学分析表明， 携带Livin-α基因与膀胱癌的发生具有统计学意义（P < 0.05），见表1。
2.3 Livin-α基因多态性与膀胱癌易感性
将44例Livin-α基因阳性患者的不同等位基因出现的情况与患者的病情程度进行统计学分析，对患者的临床分期和病理组织学分级进行了研究，见表2。膀胱癌患者的临床分期和组织病理学分级与Livin-α等位基因具有统计学差异（P < 0.05），表现为Livin-αⅠ型基因膀胱癌患者的临床分期和组织病理学分级更加恶化，具有此类基因的患者癌症的发生、发展更加迅速，易感性更强。
3 讨论
膀胱癌在我国是较为常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，具有多发、容易复发等特点，临床上主要以手术治疗为主。膀胱癌与多种癌基因和抑癌基因之间的关系研究已有了许多报道，例如：Ras、CCND1等癌基因，以及p53、Rb抑癌基因等[6-12]。Livin抑癌基因与膀胱癌之间的关系研究同样也有报道，目前的研究结果表明，Livin-α基因在膀胱癌患者中是高度表达的，而正常对照人群几乎检测不到此基因的存在，因此认为Livin-α与膀胱癌的发生、发展具有密切的联系。Gazzaniga等人采用逆转录PCR法检测膀胱癌患者的Livin-α基因，阳性率为23%，而本研究结果显示，Livin-α在膀胱癌患者中的阳性率高达55.0%，几乎为Gazzaniga等研究结果的2倍。国内有部分学者也对膀胱癌患者中Livin-α基因的携带情况进行了调查研究[13-26]，总体阳性率水平均在50%以上，这与本研究结果相一致。因此，推测Livin-α基因在不同人群、地区中膀胱癌患者的阳性表达情况具有一定的差异性。我国患者的Livin-α基因阳性水平明显高于国外患者水平。
本研究结果同样证实了膀胱癌患者的Livin-α基因阳性表达比对照组高，差异具有统计学意义（P < 0.05）。仅本研究而言，Livin-α基因在膀胱癌患者中的携带率高达55.0%，而对照组仅为1.5%，二者具有统计学意义（P < 0.05），表明了该基因与膀胱癌之间的关系。
目前关于Livin-α与膀胱癌的研究主要集中在二者的流行病学关联的探讨，较少有关于Livin-α基因多态性与其易感性之间的研究。本研究正是基于这样的事实，对Livin基因多态性和膀胱癌易感性之间进行初步的探讨。经过DNA扩增和测序结果表明，Livin-α基因在本院收治的患者中存在3种类型的等位基因，并且以Ⅰ型为主导。关于Livin-α基因的多态性研究在国内尚未见过报道，我们对本院收治的患者的基因测序结果表明，Livin-α基因同样存在一定的核酸序列碱基的改变，从而产生不同的等位基因，如果扩大病例的检测范围，应该还会有更过的等位基因型别出现。
经过分析表明，Livin-α基因的多态性与患者的临床分期和病理分级等具有统计学差异，具有Livin-αⅠ型等位基因的患者肿瘤的发生、发展强度更大，患者预后较不理想，患者具有较高的膀胱癌易感性。因此，对膀胱癌患者的Livin-α基因进行等位基因的分析有助于早期发现患者的肿瘤易感性，从而能较早地采取针对性的防治措施，最大限度地优化患者的治疗方案。
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【关键词】 胃肿瘤；Runx3；免疫组织化学
Expression and clinical significance of Runx3 in gastric carcinoma LI Hang, WU Li,min. Department of Oncology, Affiliated Hospital of Putian University,Fujian 351100,China
【Abstract】 Objective To study the expression and clinical significance of Runx3 in gastric carcinoma.Methods The expression of Runx3 were detected by SP immunohistochemical technique in 80 cases of gastric carcinoma,20 cases of normal gastric mucosa and 20 cases of atypital hyperplasia.Results Compared with normal gastric mucosa(90%) and gastric atypital hyperplasia tissue(60%),the positive rate of Runx3 in gastric cancer(35%) was significanty lower (P
【Key words】 Gastric carcinoma;Runx3;Immunohistochemistry
基金项目：福建省莆田市科技局项目(项目编号：2006S14,4)
Runx3基因是近年来发现的一种新的抑癌基因，是runt基因家族成员之一。runt基因家族是一个高度保守的基因序列，在细胞生长发育过程中起重要作用。研究发现［1］，Runx3失活或缺失与胃癌发生发展关系密切。为探讨Runx3基因在胃癌的表达及临床意义，本研究拟采用免疫组织化学SP法检测胃癌组织 、不典型增生组织及正常胃黏膜Runx3基因情况，为揭示胃癌发生、发展、预后规律提供新的依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集临床及病理资料完整的福建省莆田学院附属医院2007~2009年手术切除胃腺癌患者的原发灶蜡块标本80例，全部病例术前均未行任何抗肿瘤治疗，其中男53例，女27例，年龄38~78岁，平均53岁。按1997年UICC制定的标准进行TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期31例，IV期13例；伴淋巴结转移者31例，未转移者49例。高分化15例，中分化17例，低分化48例。另取同时期胃镜下胃黏膜不典型增生组织及正常胃黏膜组织各20例作为对照。
1.2 方法 将存档的石蜡标本重新制备4 μm切片行免疫组织化学SP法染色，具体操作严格按实验室说明书进行。Runx3兔抗人多克隆抗体盒、生物素标记二抗 均购自武汉博士德生物工程有限公司，0.1 mol/L枸橼酸盐缓冲液(DBS)自配，DAB墨色剂、防脱片剂APES购自北京中杉生物技术有限公司。用已知的Runx3阳性的结肠癌切片染色作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 制定标准 以组织核膜或胞浆内出现棕蓝色或棕褐色颗粒为阳性。每一切片观察5个不相连的视野，每个视野计数100个细胞，计算每张切片染色细胞百分率。根据染色细胞所占比例，将Runx3的阳性率分成4个等级：染色细胞比例>50%为强阳性(+++)；26%~50%为阳性(++)；10%~25%为弱阳性(+)；
1.4 统计学方法 所有数据的统计及分析使用SPSS 13.0统计软件已处理。各指标间差别检验均应用χ2检验，P
2 结果
2.1 Runx3在胃癌不典型增生及正常胃黏膜中的表达(表1)。
表1 三组标本中Runx3的表达率
组别n,+阳性率(%)胃癌80522835不典型增生2081260正常胃黏膜2021890 注：各组间比较，P均
胃癌组Runx3阳性表达率最低，不典型增生组织明显升高，正常胃黏膜组最高，差异均有统计学意义(P
2.2 Runx3的表达与胃癌临床病理特征的关系(表2)。
2.3 胃癌高中分化组织Runx3阳性表达率为50%，低分化组为25%，差异有统计学意义(P
3 讨论
人类Runx3位于人染色体1号短臂的1p36.1，含有P1和P2两个启动子，6个外显子和1290bp开放阅读框，全长67kb，广泛表达于消化道上皮细胞，其编码蛋白是一组DNA结合转录因子，在细胞生长、发育和凋亡过程中起重要作用［2］。研究表明，Runx3是一种肿瘤抑制因子，可以抑制胃黏膜上皮细胞的增殖，促进细胞凋亡。胃癌细胞株MKN,1中Runx3能通过死亡受体途径引起细胞生长停滞和凋亡［3］。
本组实验结果显示，Runx3在正常胃黏膜组织阳性表达率90%，不典型增生组织阳性表达率60%,胃癌组织阳性表达率35%，三组阳性表达率逐渐降低，且各组差异有统计学意义(P
进一步对Runx3表达与胃癌的临床病理特征的关系进行分析，发现高中分化胃癌组织中Runx3阳性表达率比低分化胃癌组织高，差异有统计学意义(P
研究认为，Runx3基因启动子高甲基化可能是Runx3基因失活的主要机制。国内郑芸等［7］应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测胃癌患者血清Runx3基因启动子甲基化有47.6%的阳性率，而胃良性疾病的阳性率仅5.0%，健康志愿者阳性率为0，差异有统计学意义(P
至于血清Runx3基因启动子甲基化状态与本研究通过免疫组化检测胃癌组织、胃不典型增生组织Runx3表达率是否相关，还有待于今后进一步研究的结果分析。两者的联合检测，可能会对判断胃癌的临床病理特征、转移潜能、预后甚至病情转归提供帮助。
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［5］ Yoshizaki T, Enomoto T, Fujita M, et al. Frequent inactivation of Runx3 in endome trial carcinoma. Gynecol Oncol,2008, 110(3):439,444.
【摘要】 目的： 研究 葡萄糖对l02细胞肝x受体(lxrα)与血管生成素样蛋白3(angptl3)基因表达的 影响 ，探讨lxrα在糖尿病和脂代谢联系中的作用. 方法 ： 用5.6, 7.0, 11.1, 28.0和33.0 mmol/l的葡萄糖培养l02细胞，5.6 mmol/l组作为对照组.用胆固醇酶联法测定各组细胞内胆固醇含量，采用rtpcr方法检测lxrα和angptl3的mrna表达量. 结果： 高浓度葡萄糖可促进l02细胞内胆固醇含量上调lxrα和angptl3 mrna表达，变化差异均有统计学意义(p<0.05). 结论： 高浓度葡萄糖增加angptl3表达，可能是通过增加细胞内总胆固醇含量而激活lxrα，而lxrα的激活则引起angptl3基因的高表达.
【关键词】 血管生成素样蛋白3；肝x受体α； 糖尿病
【abstract】 aim: to investigate the effects of glucose on expressions of lxrα and angptl3 in l02 cell, and to explore the relation of lxrα with the development of diabetes mellitus accompanied with hyperlipoproteinemia. methods: l02 cells were cultured separately in mediums containing 5.6, 7.0, 11.1, 28.0 and 33.0 mmol/l glucose, among which 5.6 mmol/l glucose group was taken as control. quantitative analysis of intracellular cholesterol content was performed by cholesterol enzyme link assays. the lxrα and angptl3 mrna were determined by reverse trancriptase polymerase chain reaction (rtpcr). results: the expression of lxrα and angptl3 mrna increased with the increase of the glucose concentration. the levels had significant difference (p<0.05). the contents of total cholesterol also increased significantly in l02 cell, and had significant difference (p<0.05). conclusion: glucose may interfere angptl3 mrna through incresasing total cholesterol, activating lxrα. the activation of lxrα upregulates the expression of angptl3.
【keywords】 angiopoietinlike protein 3; lxrα; diabetes mellitus
0 引言
肝x受体（liver xactivated receptor, lxrs）是核受体超家族的成员，包括两种同源亚型lxrα(nr1h3)和lxrβ（nr1h2）. lxrs作为甾醇类感受器调节一系列与脂质代谢相关基因的表达. 血管生成素样蛋白3（angiopoietinlike protein 3, angptl3）是新的lxrs靶基因，在脂质代谢中有重要作用［1-2］. 本研究以人肝细胞株l02为研究对象，从细胞水平研究葡萄糖对lxrα和angptl3基因表达的影响，探讨lxrα在糖尿病和脂代谢联系中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝细胞株l02（重庆医科大学基础医学研究所）；rpmi 1640普通培养基（美国gibco公司）；新生牛血清（杭州四季青公司）；rt试剂盒（日本toyobo公司）；pcr试剂盒（广州东盛生物公司）；lxrα, angptl3和βactin引物（上海生物工程公司合成）；胆固醇酶联试剂（浙江伊利康公司）；pcr仪,geldoc 100凝胶成像仪（美国biorad公司）.
1.2 方法
1.2.1 细胞分组及培养 l02细胞以每孔3×105个细胞接种于培养板.在含100 ml/l新生牛血清的rpmi 1640培养液中培养36 h后，随机分为5组（g1～g5），分别在不同浓度葡萄糖的培养液中培养24 h. g1组为对照组.
1.2.2 胆固醇含量测定 5组l02细胞用rpmi 1640培养基培养24 h后，用pbs洗细胞2次，加细胞裂解液裂解细胞，30 min后再超声裂解4次，4℃ 12 000 g离心15 min. 用lowry法测定细胞裂解液的蛋白质含量. 胆固醇酶联法测定细胞裂解液的胆固醇含量. 胆固醇含量参数以细胞裂解液胆固醇含量除以细胞裂解液蛋白质含量表示(mg/g).
1.2.3 两种基因mrna表达的检测 按试剂说明，常规方法提取细胞总rna，检测总rna的纯度和完整性. 用rtpcr方法检测各基因的mrna表达量. lxrα上游引物：tcc cac gga tgc taa tg，下游引物：tcc cag gaa tgt ttg cc. angptl3上游引物：tcc aga aca ccc aga agt aac，下游引物：cca gcc tcc tga ata acc ct. βactin上游引物：tcc tcc ctg gag aag agc ta，下游引物：tca gga gga gca atg atc ttg. . pcr反应条件为：94℃预变性4 min后进行94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环，72℃延伸10 min. 取各基因扩增产物6 μl用于25 g/l琼脂糖电泳，溴化乙啶染色后采集图像,用angptll3，lxrα与βactin面积灰度值的比值表示各基因mrna的表达量.
统计学处理：用spss 13.0软件包进行统计 分析 . 数据以x±s表示，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用lsdt检验，p<0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 葡萄糖对细胞内胆固醇含量的 影响 随着环境葡萄糖浓度增加， 细胞内胆固醇含量也不断增加， g1～g5五组间总胆固醇含量相比较，差异具有统计学意义(p<0.05) . g2～g5组分别与g1组相比，g2组的总胆固醇升高，但差异无统计学意义(p>0.05)，而g3～g5组差异均有统计学意义(p<0.05). g3组，g4组和g5组三组间两两比较，差异均无统计学意义(p>0.05，表1).
表1 葡萄糖对l02细胞angptl3与lxrα表达和胆固醇含量的影响（略）
ap<0.05 vs g1.
2.2 葡萄糖对lxrα和angptl3 mrna表达的影响 随着葡萄糖浓度增加， lxrα和angptl3的mrna表达量均增加，g1～g5各组间相比较差异具有统计学意义(p<0.05). g2组与g1组比较，lxrα和angptl3 的mrna表达量升高，但差异无统计学意义(p>0.05)，g3～g5组分别与g1组比较，lxrα和angptl3 的mrna表达量差异均有统计学意义(p<0.05). g3组，g4组和g5组三组间两两比较，差异均有统计学意义(p<0.05，图1，2).
m：marker；1～5：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/l组.
图1 葡萄糖对l02细胞lxrα mrna表达的影响（略）
m：marker；1～5：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/l组.
图2 葡萄糖对l02细胞angptl3 mrna表达的影响（略）
2.3 葡萄糖对angptl3蛋白质表达的影响 在蛋白质表达水平，g2～g5组分别与g1组比较，差异均有统计学意义(p<0.05) .此外，g2～g5组间两两比较，除了g4组与g5组差异无统计学意义(p>0.05)，其它各组间差异均有统计学意义(p<0.05，图3).
1～5：依次为葡萄糖5.6，7.0，11.1，28.0，33.0 mmol/l组.
图3 葡萄糖对l02细胞angptl3蛋白质表达的影响（略）
3 讨论
lxr是配体激活的转录因子［3］，其最有效的内源性激动剂是胆固醇的衍生物.大量 研究 表明lxrs可调节一系列与脂质代谢相关基因的表达，而维持脂质代谢的平衡［4］.angptl3是典型的lxr靶基因，在其启动子区域有lxr反应元件［5］，angptl3主要通过抑制脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, lpl)的活性导致以及低密度脂蛋白(very lowdensity lipoprotein, vldl)三酰甘油升高为主的高脂血症.已有研究表明，高浓度葡萄糖能上调细胞内angptl3的mrna和蛋白质表达，且在一定范围内呈正相关［6］. 本实验发现高浓度葡萄糖能增加l02细胞内胆固醇含量，但当葡萄糖浓度高于11.0 mmol/l后，葡萄糖对细胞内胆固醇的合成影响不明显，同时高浓度葡萄糖还上调了lxrα和angptl3的表达.kaplan等［7］研究发现高胆固醇饮食的小鼠肝脏angptl3表达明显增加，lxr激动剂t090137也会提高angptl3 mrna的水平.这与本实验结果是相符合的.结合本实验结果和 文献 报道，我们可以推测高糖可能通过增加细胞内胆固醇含量而激活lxrα，lxrα的激活能引起angptl3的mrna和蛋白质高表达，angptl3高表达可导致脂类代谢紊乱.因此，良好地控制血糖浓度，能够有效地维持糖和脂类的代谢平衡，lxrα和angptl3可能成为联系糖和脂类的代谢的重要分子.
【 参考 文献】
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［4］ 吴 静，张志文，管又飞.lxrs在脂质代谢中的作用［j］.生理 科学 进展,2004,35(1):69-72.
［5］ inaba t,matsuda m, shimamura m, et al. angiopoietinlike protein 3 mediates hypertriglyceridemia induced by liver x receptor［j］. j biol chem, 2003, 278(24): 21344-21351.
【摘要】目的：观察高浓度葡萄糖对人肝细胞株（L02）及胰岛素抵抗细胞模型（IRL02）的血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）表达的影响，探讨ANGPTL3与糖尿病（DM）并发高脂血症的关系，在细胞水平分析DM并发高脂血症的分子机制.方法：以L02为研究对象，并建立胰岛素抵抗模型（IRL02）.L02和IRL02两组细胞分别在含5.6，7.0，11.1，28.0和33.0mmol/L葡萄糖的培养液中培养，5.6mmol/L组作为对照组.用RTPCR方法检测ANGPTL3的mRNA表达量，并用WesternBlot方法检测ANGPTL3蛋白质表达水平，分析ANGPTL3与DM并发高脂血症的关系.结果：高浓度葡萄糖可促进L02和IRL02两组细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达，并呈一定的量效关系，变化差异均有统计学意义（P<0.0001）；IRL02细胞对葡萄糖的刺激尤为敏感（P<0.0001）.结论：高浓度葡萄糖可上调ANGPTL3的基因和蛋白质表达，其在DM并发高脂血症中可能起重要作用.
【关键词】血管生成素样蛋白3；糖尿病；高脂血症；葡萄糖；胰岛素抗药性
0引言
人血管生成素样蛋白3（angiopoientinlikeprotein3，ANGPTL3）是Mr约为70ku的分泌蛋白，由460个氨基酸组成，其氨基端的螺旋样结构域与调节脂质代谢的功能相关，主要在肝脏中表达［1］.ANGPTL3可通过抑制脂蛋白脂肪酶（lipoproteinlipase，LPL）的活性导致以极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein，VLDL）三酰甘油升高为主的高脂血症.脂代谢与糖代谢在多个环节相互作用，共同影响糖尿病（diabetesmellitus，DM）的发生与发展.血脂异常是DM的危险因素，而有关ANGPTL3与DM相关性的研究目前国内外都极少报道.本实验通过研究高糖环境下人肝细胞株（L02）及其胰岛素抵抗细胞模型（insulinresistantL02，IRL02）ANGPTL3的mRNA和蛋白表达量变化，分析葡萄糖对该基因表达的影响，拟从分子水平探讨ANGPTL3在DM并发高脂血症中的病理生理作用.
1材料和方法
1.1材料L02（重庆医科大学基础研究所）；RPMI1640培养基，1∶125胰蛋白酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；RTPCR试剂盒（宝生物大连有限公司）；ANGPTL3基因引物和βActin引物，胰岛素（上海生物工程技术服务有限公司）；ANGPTL3小鼠mAb和βActin小鼠mAb（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠mAb，PVDF膜（北京鼎国生物制品公司）；免疫印迹（WesternBlot）试剂盒（SantaCruz公司）.PCR仪，微型电转移装置，GelDoc100凝胶成像仪（美国BioRad公司）.
1.2方法
1.2.1细胞培养和胰岛素抵抗模型的建立L02细胞用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液在50mL/LCO2,37℃条件下培养，选取对数生长期的细胞用于实验.用含5×10-7mol/L胰岛素的培养液培养16h的L02细胞代替胰岛素抵抗模型，称为IRL02细胞，以在不含胰岛素的培养液中培养16h的L02细胞为对照.细胞计数,接种后随机分为L02细胞组和IRL02细胞组.其中L02细胞组在上述条件培养16h，更换无血清培养液培养24h后，又分为G1~G5五个亚组，分别用含5.6，7.0，11.1，28.0，33.0mmol/L的葡萄糖培养液培养24h，设G1为对照组.IRL02细胞组：除用含5×10-7mol/L胰岛素的培养液替换胎牛血清培养L02细胞外，其它培养条件和时间与L02细胞组完全相同，同样分为IRG1~G5五个亚组，设IRG1为对照组.
1.2.2RTPCR检测ANGPTL3的mRNA表达量按总RNA抽提试剂盒说明操作提取细胞总RNA，用UV法定量分析RNA得率和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性.cDNA合成（10μL反应体系）：取MgCl22μL，10×RT缓冲液1μL，无核酸酶蒸馏水3.75μL，dNTP混合液1μL，RNA酶抑制剂0.25μL，AMV逆转录酶0.5μL，随机引物0.5μL，总RNA(300ng)1μL.逆转录反应条件：30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min，所得产物用于PCR扩增.PCR反应：采用PrimerPremier5.0软件设计ANGPTL3引物和βActin引物.ANGPTL3上游引物序列：5′TCCAGAACACCCAGAAGTAAC3′，下游引物序列:5′CCAGCCTCCTGAATAACCCT3′；βActin上游引物序列:5′TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA3′，下游引物序列：5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′.ANGPTL3和βActin反应同管进行，终体积50μL.PCR反应条件：94℃2min，1个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共35个循环.取8μL反应液进行25g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集图片，QuantityOne软件分析，将ANGPTL3与βActin面积灰度值的比值作为ANGPTL3的mRNA表达量参数.
1.2.3WesternBlot检测细胞ANGPTL3的蛋白质表达量提取细胞总蛋白质，Lowry法测定总蛋白浓度.WesternBlot：蛋白质提取液（含60μg总蛋白）与5×SDS上样缓冲液按体积比4∶1混合，常规处理后进行100g/LSDS聚丙烯酰胺电泳，电转过夜，将蛋白质转至PVDF膜.常规WesternBlot方法操作，ANGPTL3
mAb1∶1000稀释，βActinmAb1∶5000稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠mAb1∶5000稀释.凝胶成像系统采集图像，QuantityOne软件分析，ANGPTL3与βActin的面积灰度值比值作为ANGPTL3的蛋白质表达参数.
统计学处理：数据用x±s表示，用SAS9.1软件分析，采用析因设计方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1实验整体统计结果由表1可见，随着葡萄糖浓度增加，L02细胞及IRL02细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达量也随之增加，对mRNA表达影响的析因设计方差分析结果为F=84.14,P<0.0001；对蛋白质表达影响分析结果为F=115.93,P<0.0001，差异均有统计学意义.在mRNA水平，葡萄糖浓度的影响：F=178.67，P<0.0001；细胞组间比较：F=6.33，P<0.05；葡萄糖浓度与细胞组比较：F=9.07，P=0.0002.即葡萄糖对ANGPTL3的mRNA表达有明显影响，在葡萄糖不同浓度组、不同细胞组和两者的交互作用方面差异均有统计学意义.在ANGPTL3蛋白质表达方面，葡萄糖浓度变化对ANGPTL3表达影响的F=181.05；细胞组间比较F=194.72；浓度与细胞组间比较F=31.11，三者差异均有统计学意义（P<0.0001）.表1葡萄糖对L02细胞和IRL02细胞ANGPTL3表达的影响
2.2不同浓度葡萄糖对L02细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达的影响结果显示，在mRNA水平，G2组与G1组比较，虽然表达量有升高，但两个亚组间差异无统计学意义（P>0.05）.说明ANGPTL3的基因表达对低葡萄糖浓度刺激不太敏感；而G3~G5组与G1组比较，差异均有统计学意义（P<0.0001）.5个亚组间任意两组两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05），即当葡萄糖浓度升至11.1~33.3mmol/L时，L02细胞ANGPTL3的mRNA表达升高（表1,图1）.在蛋白质表达水平，G2~G5组与G1组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；此外G1~G5组各组间两两比较，除G4组与G5组呈现表达量虽升高，但差异无统计学意义（P>0.05）外，其它各组间差异均有统计学意义（P<0.05），显示高浓度葡萄糖可促进L02细胞ANGPTL3蛋白质的表达（表1，图2）.
2.3不同浓度葡萄糖对IRL02细胞ANGPTL3表达的影响在IRG1~IRG5五个亚组细胞间ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达量比较（表1，图3），差异均有统计学意义（P<0.0001，）.在mRNA水平，IRG2~IRG5各组与IRG1组间比较，以及各亚组间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.0001），显示高糖可明显刺激IRL02细胞ANGPTL3的mRNA表达，使其显著升高.在蛋白质表达水平（表1，图4），IRG2~IRG5各组与IRG1组比较差异均有统计学意义（P<0.0001），即随培养液中葡萄糖浓度的增加，ANGPTL3蛋白质的表达明显升高.IRG2，IRG3和IRG5组组间两两比较显示差异有统计学意义（P<0.0001）；IRG3与IRG4，IRG4与IRG5组比较差异无统计学意义（P>0.05）.显示在极高浓度葡萄糖环境中，ANGPTL3蛋白质表达数量的增加已受到限制.
2.4同浓度葡萄糖对L02和IRL02两组细胞ANGPTL3表达的影响两组细胞ANGPTL3的mRNA表达，除葡萄糖浓度5.6mmol/L组IRL02细胞的表达量低于L02细胞外；其它各组均呈现IRL02细胞表达量明显高于L02细胞(表1).比较同葡萄糖浓度两组细胞mRNA表达量，结果显示，除7.0mmol/L和11.1mmol/L组IRL02细胞的表达虽比L02细胞增高，但差异无统计学意义（P>0.05）外；其余三组葡萄糖浓度对任意两组细胞的影响差异均有统计学意义（P<0.05）.在ANGPTL3蛋白质表达水平，IRL02细胞的表达量除葡萄糖5.6mmol/L组低于L02细胞外，其它各组ANGPTL3的表达均明显高于L02细胞组（表1），且各浓度葡萄糖对两组细胞ANGPTL3表达的影响除葡萄糖5.6mmol/L组外，其它组组间差异均有统计学意义（P<0.0001）.
3讨论
DM导致患者死亡的最常见原因是心血管并发症，2型DM患者约有58%死于动脉粥样硬化性心血管病，其特征是胰岛素（相对）缺乏和胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗常引起内源性胰岛素过渡分泌，严重的高胰岛素血症因对LPL的激活作用明显减弱可引起三酰甘油水平升高［2］，并与血糖控制不满意密切相关.本研究结果显示，高糖可明显刺激L02细胞ANGPTL3的mRNA和蛋白质表达，在IRL02细胞高糖对该基因的上调作用更加明显，说明ANGPTL3基因的表达在体内极可能受血糖的调控，提示高血糖可以通过上调ANGPTL3的表达促进高脂血症的发生与发展，ANGPTL3与DM及其相关高脂血症密切相关.实验结果还显示，当环境葡萄糖浓度升高到7.0~33.0mmol/L时，IRL02的ANGPTL3基因和蛋白质表达量都显著增加，并有剂量依赖性，但当细胞处于葡萄糖浓度为5.6mmol/L时，ANGPTL3的基因和蛋白质表达反而降低，说明良好地控制血糖对预防DM脂代谢紊乱有重要意义.有关胰岛素抵抗血糖异常状态下，胰岛素信号通路可能通过上调ANGPTL3的表达导致血脂升高的具体机制我们正在进一步研究.
ANGPTL3大量表达可引发三酰甘油升高为主的高脂血症［3］.而高三酰甘油血症参与了一系列代谢性疾病的发病过程［4-5］.ANGPTL3的大量表达还可促进脂肪细胞的脂解作用，释放大量FFA［6］，而FFA是肥胖导致IR的一项重要因素［7］；摄入高脂饮食和循环中的游离脂肪酸浓度增高可导致外周组织和肝脏的胰岛素抵抗，进而产生2型DM和代谢综合征［8］.我们的研究结果提示，胰岛素抵抗引发的高血糖状态可通过上调ANGPTL3的表达，导致循环中三酰甘油和FFA增高，发生高脂血症，而增高的三酰甘油和FFA又加重了肝脏及外周组织的胰岛素抵抗，形成恶性循环，互为因果.有研究还发现ANGPTL3基因是L
XR的直接靶点［9-11］.对LXR的研究发现葡萄糖是其内源性配基［12］，提示葡萄糖上调ANGPTL3的表达机制可能与LXR有关.
综上所述，ANGPTL3可能是DM和高脂血症发生、发展和桥接的关键点，对于ANGPTL3的基础研究有助于DM，高脂血症等代谢性疾病的病因学的发展，而针对ANGPTL3表达的调控和干预有望成为治疗这类疾病的新型治疗手段和途径.
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关键词：语言体系；词汇；俄语词典
中图分类号：H35 文献标识码：A文章编号：1005-5312（2011）29-0202-01
众所周知，词汇是各种各样语言联系的基本单位，它在一定程度上符合各种语言的标准。首先是在发音上或是音位上，因为语言的使用是通过声音传达的（确切的说是通过语言体系中能够区分词义的最小的语音单位―音位传达的），其次是在构词上，因为非派生的根源词是新的词汇创立的基础，这些新词都是在非派生根源词的基础上产生的。再次是在词法上，就自己语言的词汇语义特点构成一定体系的词类，例如：表示物体意义的词都属于名词，表示动作或状态意义的词都属于动词等等。最后是在句法学上，因为一个词要想实现它的语义特点就必须与其它词汇相连，也就是说在词组中，在句子中或者是在更复杂的句法结构中才能实现其词汇的语义特点。词汇之间的联系可以清楚构词和词法上的特点，所以要想弄清楚其它语言就必须巩固和结合现代通语体系。
同时词汇是词汇语义体系最基础、最独立的内部有组织的统一体，词汇间的要素总是固定的彼此间相互联系。
在理解词汇语义上包括两个彼此间相互制约的特点：第一，词汇体系就是词汇单位的总和（即:单词，词组）。第二，词汇体系就是词汇单位，方法的组织形式。在各式各样的语言学词典中语言词汇的构成经常被提到。在这类词典中揭示了词汇体系的特点，但是很多情况下词汇单位的语义特点在这类词典中都是相对限制的。在1895 年巴克罗兹斯基在自己《古俄语语义研究》一书中提到：词汇和意义彼此不能分离，应该紧密的联系在一起，这并不取决于我们的认识，并且应该注意的是就词汇意义而言，对别性和相似性是词汇分类的基础。
词汇就其语义分类可以分为下列几点：1.非语言特点是词汇语义分类的基础。例如：专题类词汇、词组或与其相关的相近词和词组。应该注意的是非语言因素的词汇语义体系的非语言因素是指事物、现象和客观世界概念联系的本身。2.特殊的语言特点是词汇语义分类的基础。也就是说就词类、词汇语义和语法形式的特点对词汇语义进行分类。3.语言修辞特点是词汇语义分类的基础。换言之，语义词汇的分类是通过语言色彩和情感的表达实现的。
但是无论词汇语义是按照何种原则分类，它都是基于某种相似的特点。例如：方凳、长沙发、长椅、安乐椅......这些词共同的语义特点都是家具，但在其中由于使用方式不同，有的用于坐或躺，将其从总的家具概念中划分出来，从而构成词汇语义的聚合体，也就是说语言体系要素的总和。在同一类别中词汇的关系是聚合关系。
现代语言研究者指出根据语义类别中词汇的对别性和语义特点可以将词汇聚合体从中分离出来。
同时应该注意的是，同一个词也可以有不同的聚合派别。例如：шествовать它可以属于同 идти，передвигаться相同的语义类别。但是就其相反意义，它也可以属于同 стоять，недвигаться相同的类别。
综上所述，聚合关系在词汇学中是多变的，复杂的。
同时组合关系也是词汇联系体系的一种现象，它同聚合关系相比较，更取决于文章的语境。句法的关系在实现词汇意义的过程中即在词汇搭配的过程中起到了关键的作用。1.词汇的搭配―是词义上的关系，它取决于思维的逻辑性。2.句法的搭配―是言语中词汇联系的法则。
词汇的搭配在很大程度上影响着新词意义的发展（首先是在边界词中，然后是在词汇的语义结构上）。
在词汇学中出现了与某词有关联的具有派生意义的词，也就是说这些词的意义取决于原词。例如：ветряной-ветер-ветрянка.……这种关系叫做派生关系，这种关系的形成基于词义的联想和词汇本身的接近。
一个词不同意义间的相互作用是多种多样的，这些在总体上就构成了复杂的词汇体系，词汇体系多层性的特点如下：1.在音义形上―一个词有多种意义（多义词）；在词义的联系上存在着某种缺口（同音异义词，形近词）。2.在词汇意义的相似性和对别性上―多义词，反义词。3.在派生关系上，词汇体系的形成取决于语义结构、语法形式特点、语音要素。
因此，学习语言是不断发展变化的。通用语言体系的本质可以在实践学习的过程中逐渐被认识、理解并确定语言体系的发展道路。
参考文献：
关键词：乳腺癌；Bmi-1；Mel-18
B细胞特异的莫罗尼白血病插入位点1基因（Bmi-1）作为多梳基因家族（PcG）的重要成员，属于原癌基因，定位于染色体畸形相关区域，在各种肿瘤疾病的形成和发展中，都起到了非常重要的作用。黑色素瘤白质（Mel-18）同样被称之为多梳基因环指蛋白2（PCGF2），Mel-18蛋白与Bmi-1蛋白有着93%的同源性，而基因则与Bmi-1有着70%的同源性。有报道指出Mel-18可能属于一种癌基因，但同时也有报道证实其属于抑癌基因，但其在肿瘤发展中发挥了重要作用[1]。鉴于此，本研究通过实验，对Bmi-1、Mel-18在乳腺癌组织中的表达进行了解，并分析其病理意义，旨在为乳腺癌的临床诊治提供新方向。
1 材料与方法
1.1 材料
选取广东药学院附属医院2014年1月-2015年3月接诊的乳腺癌手术治疗患者，选取36例，患者年龄为24-66岁，平均年龄为（50.22±13.05）岁；根据AJCC第6版分期标准[2]对乳腺癌进行分期：4例Ⅳ期，7例Ⅲ期，11例Ⅱ期，14例Ⅰ期；所有患者术前均未接受任何治疗，且经术后病理组织标本确诊。另从同期健康女性中，选取36例作为对照组，取正常乳腺组织，且经病理学诊断均为正常组织。所有标本均在离体30min内完成采集，分别取2份，1份采用10%福尔马林溶液对其进行固定处理，经石蜡包埋处理和切片备用；1份置于液氮内，放置于-80℃环境下保存。两组均签订知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR实验 运用Trizol对各乳腺组织总RNA进行提取。购入Bmi-1、Mel-18上下游引物。PCR反应条件：经94℃行2min预变性，同温度下行30s变性；经48℃行30s退火；经72℃行45s延伸；再次经94℃行30s变性；经48℃行30s退火；经72℃行45s延伸。按照上述方法连续进行35个循环处理后，再进行10min延伸处理；对PCR反应后产物进行电泳处理，同时采用凝胶显像对结果进行分析，同时通过β-actin片段灰度值和基因片段的比值，来作为相对表达水平。
1.2.2 免疫组织化 购入Bmi-1抗体、Mel-18抗体，浓度设定为1：100。对组织切片进行脱蜡水化处理；运用3%对其行灭火内源性过氧化物酶处理；采用柠檬酸修复抗原，血清封闭，向其中加入一抗，置于4℃环境内过夜。采用磷酸盐缓冲液对抗体进行替代，并将其作为空白对照，在经过二氨基联苯胺行显色处理后，采用苏木素进行反复的复染和水洗，使其能够完全透明，并通过中性树胶封片，进行镜检。根据染色强度进行计分，标准为：4分（重度染色）；3分（中度染色）；2分（弱染色）；1分（阴性）；对两者相乘结果作为判断依据，若结果≥4分，即可判定为阳性表达，反之则为低表达。根据着色细胞数/视野细胞总数×100%进行计分，标准为：4分（>75%）；3分（51%-75%）；2分（11%-50%）；1分（≤10%）。
1.3 统计学方法
选取统计学软件SPSS20.0对本研究数据进行统计分析。以均数±标准差（X+S）表示RT-PCR结果，运用LSD法对组间结果进行检验；采用卡方对蛋白表达进行检验；若P
2 结果
2.1 乳腺癌组织中Bmi-1、Mel-18的mRNA表达
对照组乳腺组织Bmi-1 mRNA表达量为（0.598±0.05），Mel-18 mRNA表达量为（0.941±0.046）；乳腺癌组患者乳腺组织Bmi-1 mRNA表达量为（0.934±0.063），Mel-18 mRNA表达量为（0.617±0.023）。两组Bmi-1、Mel-18的mRNA表达对比，差异均有统计学意义（P
2.2 乳腺癌组织中Bmi-1、Mel-18的蛋白表达
对照组乳腺组织Bmi-1蛋白表达率为31.2%，Mel-18蛋白表达率为72.6%；乳腺癌组患者乳腺组织Bmi-1蛋白表达率为80.4%，Mel-18蛋白表达率为27.3%。两组Bmi-1、Mel-18蛋白表达对比，差异均有统计学意义（P
2.3 乳腺癌组织中Bmi-1、Mel-18表达与病理特征关系
乳腺癌组织中Bmi-1与Mel-18的mRNA表达中，淋巴结转移、临床分期对比，差异有统计学意义（P0.05）；乳腺癌组织中Bmi-1与Mel-18蛋白表达，在病理特征中对比，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨论
Bmi-1属于PcG家族中具有代表性的基因。已有研究者通过动物实验证实[3]，Bmi-1可对INK4a/ARF位点进行调控，致使p53与pRb受到影响。且与Bmi-1在一系列肿瘤中的研究报道也在逐渐被公开。Bmi-1在乳腺癌、鼻咽癌、卵巢癌等恶性肿瘤的发生、发展中均有参与。本研究通过对Bmi-1在乳腺癌与正常乳腺组织中的表达进行观察，结果显示，Bmi-1 mRNA表达量与蛋白表达率在乳腺癌中表现为明显升高（P
综上所述，在乳腺癌组织中，Bmi-1呈现为高表达，Mel-18呈现为低表达，为此，通过对两者进行联合检测，有助于乳腺癌的临床诊治和疾病的预防。
参考文献：
[1] 管海涛，王中卫，薛锋杰，等.Bmi-1与乳腺癌发生、发展及预后的相关性研究[J].临床肿瘤学杂志，2011，16（2）：144-147.
[2] 周晓云，徐正顺，李惠翔，等.Bmi-1在乳腺癌组织中的表达及相关性研究[J].河南科技大学学报（医学版），2010，28（1）：8-11.
关键词： 高中生物教学 可遗传变异 典型问题
遗传和变异是高中生物教材中的重点和难点，特别是分子生物学和以基因工程为核心的生物科学技术更是高考的热点和生物命题取材的重要素材。在近几年的浙江高考中占有非常大的比重。然而在这几年的教学与教研活动中，部分学生和老师对一些生物学问题的理解存在偏差，这将直接影响到他们对生物学基础知识的掌握和应用。例如：名校《创新》冲刺卷—理科综合中的一道选择题，如下：
例1：科学家为了研究抑制基因表达的机制，在基因启动子后面插入一段颠倒的转录区序列（如图所示），导致新基因转录形成的mRNA因分子内部形成互补区而失去功能。对该操作叙述不正确的是
A.需要限制酶和DNA连接酶
B.在细胞外实现了基因突变
C.干扰了基因表达的转录过程
D.转录形成的mRNA分子内部靠A―U、C―G配对形成互补区
对于该选择题几乎所有的学生都选择B选项。我在讲解试题时问他们，有没有认真审题，他们回答审题了，还有学生说用到了限制酶和DNA连接酶，这是基因工程的特点，其原理不就是基因重组吗？而该题的参考选项是C。学生不能正确判断说明对遗传变异的一些知识点如基因、基因突变、基因重组等还是不能很好地理解其实质及概念的内涵和外延，进而不能做出正确的判断。下面就遗传变异中的几个知识点进行再探究。
1.噬菌体的遗传物质是否都是DNA
教材在讲DNA是遗传物质的直接证据时运用了T2噬菌体侵染细菌的实验，得出DNA是遗传物质，大量教辅资料中的试题也认为噬菌体的遗传物质就是DNA，那么噬菌体的遗传物质都是DNA吗？
噬菌体是一类专门寄生在微生物体内的病毒，它的种类很多，有的噬菌体的头部含有双链的DNA，有的含有单链的DNA，有的则含有RNA。含有双链DNA的噬菌体的遗传物质是双链DNA，如T4噬菌体；含有单链DNA的噬菌体的遗传物质是单链DNA，如M13噬菌体；含RNA的噬菌体的遗传物质是RNA，如大肠杆菌f2噬菌体、QB噬菌体。由此可见，噬菌体的遗传物质是DNA或RNA。如果老师不讲清楚，学生对此理解不是很彻底，就会误认为噬菌体的遗传物质就是双链的DNA。
2.对基因突变的理解不够深入，浮于表面
2.1基因的概念
例2（2010年盐城第一次调研）下列过程一定能够导致DNA分子结构发生改变的是（ ？摇？摇）
A.基因突变 ？摇？摇 B.基因工程
C.染色体变异 ？摇D.同源染色体的非姐妹单体互换
此题的参考答案是A，我认为B也是可以的，此题给出的参考答案不全我认为是对基因的概念、DNA与基因的关系没有正确地理解。浙教版教材必修二第70页指出，所谓基因就是遗传的一个基本功能单位，它在适当的环境条件下控制生物的性状；从本质上讲，基因就是一段包含完整的遗传信息单位的有功能的核酸分子片段——在大多数生物中是一段DNA，而在RNA病毒中则是一段RNA。基因最初是在真核细胞中发现的，所以大多认为基因位于DNA上，是具有遗传效应的DN段。许多复习资料都以其为出题点来考基因的概念。这就是没有注意概念的广义与狭义的区别。基因一定是一段核酸片段。但核酸片段不一定是基因，只有具有遗传功能的核酸片段才是基因。如果能正确理解基因的概念，答例1题时就不会认为是基因重组了，而是一个碱基对增加比较多的基因突变，更不会认为是染色体畸变，因为基因重组和染色体畸变都涉及基因的变化。而此题只是一段没有遗传效应的DN段的增加。
2.2基因突变的时期理解误区
我们在很多资料和习题中看到基因突变发生的时间：细胞分裂间期（有丝分裂的间期和减数第一次分裂的间期），这样理解是有错误的。由于基因突变的随意性，生物个体的任何部位或任何细胞，生物个体发育的任何时期都可以发生基因突变。可见基因突变不只发生在细胞分裂间期，只不过在DNA分子复制过程中，碱基配对在诱因的作用下容易出现差错，导致基因突变率较高而已。这就是在人工诱变育种中尽量对具有分裂能力的幼嫩器官或组织进行处理的原因。自然界中诱变剂作用或DNA复制、转录、修复时，偶然出现碱基配对错误都可出现基因突变。由此可见，基因突变发生在个体发育的任何时期，但主要发生在细胞分裂的间期，其他时期也发生。
例3（2008广东理）下列有关基因突变的叙述，正确的是（ ）
A.不同基因的突变概率是相同的
B.基因突变的方向是由环境决定的
C.一个基因可以向多个方向突变
D.细胞分裂的中期不发生基因突变
在外界条件下，基因突变的方向是不定向的。一个基因可以向不同的方向发生突变，所以基因突变有的是显性突变，有的是隐性突变。细胞分裂的任何时期甚至没有分裂的细胞都会发生基因突变，只不过间期发生基因突变的频率高而已。
2.3基因突变的结果理解
基因突变的结果是产生它的等位基因，这是不对的，而是基因突变产生新基因。基因突变不一定会变为原基因的等位基因，因为只有基因突变发生在真核生物染色体上的，新的基因才是它的等位基因。如果基因突变发生在病毒、原核生物及某些细胞器的DNA上，则只能说基因突变改变了基因内部结构，产生了新基因，因为病毒、原核生物及质基因不存在等位基因。
3.基因重组理解中的误区
3.1广义基因重组和狭义基因重组
例4双眼皮的父母生了一个单眼皮的孩子，这种变异来源于（？摇 ？摇）。
A.基因突变？摇？摇 B.基因重组？摇？摇
C.染色体变异？摇？摇 D.环境的差异
该题在很多资料中都是这样分析的：双亲为双眼皮，但生了一个单眼皮的孩子，这说明双眼皮是显性，单眼皮是隐性，双亲均为显性杂合子，所生单眼皮孩子是由于控制单眼皮的基因重新组合在一起，故选B。可是中学教材对基因重组的定义是这样的：生物体在进行有性生殖过程中，控制不同性状的基因的重新组合。本题仅涉及一对等位基因，所以与“基因重组”好像无关，这样此题应该无答案。实际上高中课本中的概念隐含着广义和狭义的区别，也就是一个概念有其内涵和外延。
狭义的基因重组是指生物体在进行有性生殖过程中，控制不同性状的基因由于自由组合或基因互换而重新组合。其基因重组发生的时期是“有性生殖的过程中”，即进行减数分裂产生配子时，四分体时期同源染色体上非姐妹染色单体之间的交叉互换及减数第一次分裂后期非同源染色体上非等位基因的自由组合。
从广义上讲，任何造成基因型变化的基因交流过程，都叫做基因重组。比如说在线粒体中也有基因重组，在体细胞的细胞核中也有基因重组，在受精作用时由于两性配子的结合引起后代基因型的改变也属于广义的基因重组，植物体细胞杂交是一种特殊形式的广义上的基因重组，染色体变异可导致广义的基因重组，R型细菌和S型细菌的转化也是广义基因重组，目的基因和质粒环状DNA整合在一起也是广义上的基因重组。
高中生物学中的基因重组一般是指狭义上的基因重组和广义上的DNA重组技术。所以双眼皮的父母生了一个单眼皮的孩子，这种变异来源于广义上的基因重组。所以按照浙教版教材的理解，此题没有答案。
3.2基因重组与染色体畸变
例5科学家用纳米技术制造出一种“生物导弹”，可以携带DNA分子。把它注射入组织中，可以通过细胞的胞吞作用的方式进入细胞内，DNA被释放出来，进入到细胞核内，最终整合到细胞染色体中，成为细胞基因组的一部分，DNA整合到细胞染色体中的过程，属于（？摇 ？摇）
A.基因突变？摇？摇 B.基因重组？摇？摇
C.基因互换？摇？摇 D.染色体变异
此题的参考答案是B。
例6在正常人体细胞中，非受体型酪氨酸蛋白结合酶基因abl位于第9号染色体上，表达量极低，不会诱发癌变。在慢性骨髓癌患者细胞中，该基因却被转移到第22号染色体上，与bcr基因相融合，发生重排后基因内部结构不受影响，但表达量极高，导致细胞分裂失控，发生癌变。从变异类型上看，这种癌变的原因是（？摇？摇？摇 ？摇）。
A.基因突变？摇？摇 B.基因重组？摇？摇
C.基因交换？摇？摇 D.染色体变异
abl基因从9号染色体转移到22号染色体上，导致22号染色体上基因的种类和数量发生改变，这种变异属于染色体变异中的易位。答案为D。
两道相似的题，为什么答案不一样呢？到底哪一个是错误的呢？
基因重组是指两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。重组是核酸分子水平上的一个概念。基因重组可以分为自然重组和人为重组两大类。自然重组包括同源重组、位点专一性重组、异常重组等。人为重组主要是指遗传工程中的DNA重组技术。
无论是哪种基因重组，都侧重于“基因—基因”的重新组合。
染色体畸变是指在某些内部或外界因素的影响下，染色体数目和结构可能发生的改变。染色体变异可分为结构的变异和数目的变异两大类。数目的变异包括整倍体变异和非整倍体变异。染色体结构变异指染色体部分片段的缺失、重复或重排。该种变异皆由染色体的断裂引起，其基础是染色体的断裂或断裂后的异常连接。
根据“染色体断裂愈合学说”可知，其侧重于“染色体片段—染色体”的连接，是染色体水平的“基因重组”。
abl基因从9号染色体转移到22号染色体上，也就是“外源基因（仅仅是基因）最终被整合在另一条染色体上”，涉及的是“基因—染色体”的结合。染色体是基因的载体，故“基因—染色体”的结合必然有“基因—基因”的重新组合，该过程虽然使染色体上基因的种类和数量增多，但不会出现“染色体片段—染色体”的连接。因此，无论按中学教材还是大学教材，该过程都应该属于基因重组的范畴。
另外，染色体结构变异是指由于染色体片段的丢失、重复、易位、倒位而引起的染色体结构的改变，发生变化的染色体片断上往往含有多个基因。
所以，按照这两道题变化的实质来讲，都属于广义上的基因重组的范畴。按照现行教材所讲的基因重组的概念，两者都是染色体畸变，但教师必须清楚其变化的实质。
在教学中对于一些有争议或不同说法的问题时，我们如何教学呢？要尊重教材，以教材为本，以教材的概念的内涵和外延为准，如果教材的概念是狭义的，则可以适当补充其广义的概念。一些争议较大的习题可以在教学中删去，但是教师之间可以通过查找资料进行交流，这是提高教师专业素质的很好的机会。
参考文献：
[1]赵德强.高中生物教学中的广义和狭义概念.生物学教学，2006（7）.
[2]周德庆编著.《微生物学教程》第二版P223.
[3]高中美.容易被误解的几个生物学问题.中学生物教学，2008（12）.
罗哌卡因是酰胺类局麻药，以其毒性小、麻醉效果确切、安全范围大、维持时间长等优点，已经广泛用于成人硬膜外阻滞、蛛网膜下腔阻滞、臂丛阻滞及颈丛阻滞麻醉中，而应用于小儿臂丛麻醉的报道较少，本次研究旨在探讨在氯胺酮基础麻醉下不同浓度的罗哌卡因用于小儿臂丛麻醉阻滞的安全性和有效性。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2007年1月至2007年12月绍兴第二医院骨科上肢骨折患儿60例，其中男性41例，女性19例，年龄2～10岁，平均（5.72±1.20）岁，体重12～36kg，平均（26.25±2.22）kg，其中肱骨、尺挠骨折需行清创内固定术者32例，手腕、手掌、手指及其他创伤需行清创内固定术者25例，断指再植者3例。手术时间50min～4.5h，平均(2.55±0.83)h。应用美国麻醉医师协会（American statistical association，ASA）标准分级为Ⅰ～Ⅱ级，无明显心、肝、肾疾病及其他遗传病和血液系统疾病及药物过敏史，随机分成三组 ，每组20例。三组间一般资料比较见表1。三组性别、体重、年龄、手术时间等差异均无统计学意义（P均＞0.05）。
1.2 麻醉方法
常规术前禁食，患儿入室前肌注阿托品0.01mg/kg，咪达唑仑0.1mg/kg，氯胺酮3mg/kg（总量不超过100mg）。入睡后给予持续面罩吸氧，连续监测心电图（electro cardiogram，ECG）、血压（blood pressure，BP）、呼吸（respiratory， RR）、氧饱和度（oxy- hemoglobin saturation，SpO2），床旁吸引器备用。Ⅰ组用0.25%罗哌卡因，Ⅱ组用0.2%罗哌卡因，Ⅲ组选用0.167%罗哌卡因，常规加1：20万肾上腺素，以0.5ml/kg 选择肌间沟或腋路臂丛神经阻滞。术中如出现哭泣或头、躯干、四肢躁动者给予氯胺酮2ml/kg体重静脉注射。三组患儿均保留自主呼吸，面罩给氧.
1.3 观察指标
记录麻醉前（T0）及手术开始后1min（T1）、10 min（T2）、30 min（T3）、60 min（T4）、120min（T5）平均动脉压（mean arterial pressure， MAP）、心率（heart rate，HR）、SpO2、氯胺酮的用量、追加氯胺酮的间隔时间、患儿苏醒时间以及患儿苏醒期情况。
1.4 麻醉效果分级[1]
Ⅰ级：为穿刺和手术操作无反应；Ⅱ级；为强刺激时轻微肢动，不影响手术操作； Ⅲ级：为明显肢体扭动，需约束并追加氯胺酮方能继续手术。
1.5 统计学方法
所有数据采用SPSS 11.5统计学软件包处理。计量资料均以均数±标准差（x±s）表示。 组间均数比较用单因素方差分析(ANOVA)；计量资料比较用t检验；计数资料比较用χ2检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 三组患儿手术开始后1、10、30、60、120minHR、MBP变化见表2。
由表2可见，三组患儿在术前MAP与HR均无明显差异，Ⅰ组、Ⅱ组40例患儿术后各时点HR、MAP比较，差异均无统计学意义（t分别＝0.51、0.87、1.00、0.90、1.09，P均＞0.05）；而Ⅲ组臂丛阻滞患儿在T1、T2、T3各个时点MAP和HR明显高于术前基础值， MAP和HR与Ⅰ组、Ⅱ组比较， 在T1时点差异均有统计学意义（t分别＝5.72、7.76、5.02、2.59，P均＜0.05），在T2时点差异均有统计学意义（t分别=5.99、6.57、4.74、2.64，P均＜0.05），在T3时点差异均有统计学意义（t分别=6.08、5.38、4.58、2.23，P均＜0.05)；而在术后60min即T4和术后120min即T5各时点与Ⅰ组，Ⅱ组相比差异无统计学意义（t分别＝1.87、0.60、1.03、0.63，P均＞0.05）。
2.3 三组患儿麻醉效果，氯胺酮用量，苏醒时间及不良反应见表3
由表3可见，Ⅰ组在氯胺酮用量和苏醒时间上与Ⅱ组相比，差异无统计学意义（t分别＝0.23、0.32，P均>0.05）；Ⅲ组患儿的麻醉效果较差，与Ⅰ组、Ⅱ组相比差异有统计学意义（χ2分别＝5.58、3.96，P均＜0.05）；其氯胺酮用量与Ⅰ组、Ⅱ组比较，差异有统计学意义（t分别=11.36、4.80，P均＜0.05)；其苏醒时间与Ⅰ组、Ⅱ组相比，差异有统计学意义(t分别=11.36、4.80，P均＜0.05)。且术后躁动、精神症状、呕吐出现率均明显高于其他两组，差异有统计学意义（χ2分别＝23.02、19.80，P均＜0.05）。术后24h随访病人均无不良反应。
3 讨论
以往小儿上肢骨折手术一般在单纯氯胺酮麻醉或者氯胺酮麻醉复合臂丛麻醉下进行，操作比较复杂，对小儿生理影响较大，臂丛麻醉药物往往选用布比卡因。罗哌卡因是新型长效酰胺类S型局麻药，其理化性质介于利多卡因和布比卡因之间[1，2]，因其麻醉效果确切，神经毒性较小，并可在一定程度上产生感觉和运动神经阻滞分离的特性，应用于小儿臂丛神经阻滞，临床中已有报道[3]。本次研究旨在研究不同浓度的罗哌卡因在小儿臂丛神经阻滞中的应用，以期用最低浓度达到最佳麻醉效果。一般小儿择期手术由于麻醉医师在术前病房及准备室中与患儿均有所沟通，消除其心理恐慌，所以进入手术室后大部分小儿均能配合麻醉医师进行各种操作，但是由于急诊手术及年龄差异不同，在有些患儿，即使很小的创伤性穿刺，都可能遭到剧烈的拒绝，所以，为了达到对比的均衡和研究的合理性，本次研究中所有患儿均在术前给以一定剂量的氯胺酮基础麻醉[4]，再进行臂丛阻滞，且本次研究中三组患儿的手术时间都在50min以上，可以基本消除全凭单次肌注氯胺酮基础麻醉行手术的可能性。
小儿行臂丛麻醉中应该注意：定位必须正确，只要定位正确，不必强求异感，避免反复穿刺造成不必要的损伤和并发症，同时由于本次研究中采用了氯胺酮基础麻醉，也有可能影响异感的引出。在肌间沟入路中，注入麻药时用于定位的手指应一直固定在穿刺部位的上方压迫肌间沟上缘，迫使局麻药沿臂丛神经鞘向下扩散，可增加对尺神经的阻滞，同时也可以避免局麻药向上扩散而导致膈神经和喉返神经被损伤[5]；穿刺的时候针尖应该向下向内，避免水平方向进针过深误入硬膜外腔或者蛛网膜下腔。本法仅用于双侧阻滞，对肥胖和肌间沟定位不清的患儿慎用。
本次研究发现，在三组不同浓度罗哌卡因臂丛麻醉中，除Ⅲ组外，其他两组患儿手术中均能达到满意的镇静，镇痛及肌松效果，术中基本不用或者很少追加氯胺酮，且术后苏醒迅速，无躁狂，谵妄等其他不利影响。在苏醒时间方面，Ⅲ组与Ⅰ组、Ⅱ组比较较明显延长（P均
综上所述，在氯胺酮基础麻醉下，将0.25%和0.2%罗哌卡因用于小儿臂丛神经麻醉，阻滞时间长，麻醉效果满意，呼吸循环稳定，手术时安静，利于术者操作及术中管理。基本上单次阻滞即能满足对手术需要，也不需要追加氯胺酮，而0.167%罗哌卡因浓度偏低，不宜于用于小儿臂丛神经阻滞。
参考文献
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3 杨康， 刘洪. 小儿上肢手术臂丛神经阻滞与静脉麻醉的观察[J]. 实用医院临床杂志， 2004(1):68-69.
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